肠道屏障在多器官功能不全综合征中的发病学意义探讨

1、    肠道屏障在多器官功能不全综合征中 的发病学意义探讨        目的探讨肠道屏障的损伤机制和肠道屏障在多器官功能不全综合征(MODS)中的发病学意义。方法本实验采用酵母多糖对大鼠行腹腔注射制备MODS模型。实验用SD大鼠24只，随机分为模型组和对照组。酵母多糖剂量为1.0mg/g体重。结果MODS时外周静脉血和门静脉血中内毒素水平明显增高(P<0.01)；血和小肠组织中肿瘤坏死因子(TNF)含量升高(P<0.05)；血液中二胺氧化酶(DAO)含

2、量明显升高(P<0.01)，肠粘膜组织中DAO含量明显下降(P<0.01)；MODS时回肠粘膜出现明显病理改变，肠粘膜通透性和肠细胞渗透性明显增高。结论MODS时存在着严重的肠道屏障功能损伤，肠道屏障功能衰竭是导致MODS的重要环节，肠源性内毒素是MODS 的重要致病因子，组织过氧化损伤是肠道屏障损伤的重要原因之一。保护肠道屏障，减少肠源性内毒素的产生和吸收，防止过氧化损伤将成为防治MODS的重要措施。关键词多器官功能衰竭肠粘膜内毒素类 Damage of gut barrier in the pathogenesis of multiple organ dysfunction s

3、yndrome Chen Hailong,Wu Xianzhong,Pei Dekai,et al.Department of Surgery,Dalian Medical University, Dalian 116011.ObjectiveThis study was to determin the relationship between multiple organ dysfunction syndrome (MODS) and gut barrier failure and the effect of endotoxin derived from the gut.Methods24

4、SD rats were divided into two groups,model group(n=12) and control group(n=12).The experimental rats were sacrificed 48h after intraperitoneally injection of zymosan at a dosage of 1.0mg/g body weight.Results The levels of serum endotoxin in the peripheral and portal blood were markedly elevated(P&l

5、t;0. 01),the DAO concentrations decreased in the ileum tissue(P<0.05),but increased in the blood(P<0.01),the levels of XOD, MDA and TNF in the blood and ileum tissue significantly increased(P<0.01),the levels of GSH decreased(P<0,01).The histopathologic lesions were found in the intestin

6、e of the model group,including acute necrosis of intestinal mucosa,granulocyte infiltration, and increased permeability of intestinal mucosa and enterocytes.The multiple linear regression analysis showed that there were significant relationships among endotoxin,DAO,GSH, XOD, MDA and TNF.ConclusionsT

7、he results demonstrated that there was a severe gut barrier damage while MODS developed,gut barrier failure can lead to MODS.Endotoxin derived from the gut was the pathogenic factor of MODS and injury of the intestine caused by peroxidase can result in gut barrier failure and MODS.Key wordsMultiple

8、organ failureIntestinal mucosaEndotoxins目前，肠道屏障功能已引起人们极大的兴趣和关注。在创伤和感染等应激情况下，肠道的屏障功能受到削弱或损害，可使大量细菌、内毒素经门静脉和淋巴系统侵入体循环，造成肠源性感染和内毒素血症，并在一定条件下激发细胞因子和其它炎性介质的连锁反应，引起全身各器官的损害1,2。因此，研究肠道屏障的损伤机制、肠道屏障在多器官功能不全综合征(MODS)中的发病学意义等相关问题具有极其重要的意义。本组以酵母多糖诱发无菌性腹膜炎制备大鼠MODS模型，对上述问题进行研究和讨论。材料与方法1.实验动物及分组：SD大鼠24只，雌雄各半，体重200

9、±20g，由大连医科大学实验动物中心提供，随机分成模型组和对照组，每组12只。2.模型制备方法：无菌Zymosan粉剂(Sigma公司产品)与无菌液体石蜡制成混悬液，按1.0mg/g比例行大鼠腹腔注射，诱发无菌性腹膜炎，制备MODS模型3,4。对照组大鼠腹腔注射等体积液体石腊。造模后48小时，全部动物均在乙醚麻醉下，以1/1 000升汞消毒眼球再用生理盐水冲洗后以细玻璃管经球后静脉采血3ml；然后剖腹，经门静脉采血1ml，留测各项指标；并取部分末段回肠组织进行病理学检查和通透性测定。3.观察指标和检测方法:(1) 内毒素：外周血及门静脉血中内毒素的含量采用鲎试验偶氮基质显色法进行测定

10、。(2)还原型谷胱甘肽(GSH)：血清及肠组织中还原型谷胱甘肽含量采用荧光测定改良法5。(3)黄嘌呤氧化酶(SOD)：血清及肠组织中黄嘌呤氧化酶活性测定按吴晓生等介绍的NBT比色法进行测定6。(4)丙二醛(MDA)：血清及肠组织中过氧化脂质产物丙二醛含量的测定采用改良的八木国夫法7。(5)肿瘤坏死因子(TNF)：血清及肠组织中TNF含量用放免法进行测定。(6)二胺氧化酶(DAO)：血清及肠组织中DAO含量测定采用分光光度法8。(7)组织蛋白定量：肠组织蛋白定量测定用Lowry法。(8)肠粘膜通透性及肠细胞渗透性测定：以镧作示踪剂观察肠粘膜通透性和肠细胞的渗透性9。(9)组织病理观察方法：动物活

11、杀后取小块回肠段标本，分别置入磷酸福尔马林缓冲液和2.5%戊二醛溶液中固定。组织经过常规处理，分别以Olympus显微镜和JEM-2000EX电子显微镜观察并照相。4.统计学处理：所得结果经美国Minitab统计软件包进行数据处理。结果1.MODS时外周血和门静脉血中内毒素水平的变化：无菌性腹膜炎诱发大鼠MODS后，外周血和门静脉血中内毒素水平分别是108.07±21.56pg/ml和234.98±28.04pg/ml均明显高于对照组41.41±12.27pg/ml和59.48±11.53pg/ml(P<0.01)；对照组门静脉血的内毒素水平稍高于

12、本组外周血(P<0.05)，模型组门静脉血的内毒素水平则明显高于本组外周血(P<0.05)。2.血和小肠组织中TNF含量的变化：模型组血清和肠匀浆中TNF含量分别是2.70±0.33g/ml和3.44±0.40ng/mg pro,明显高于对照组1.62±0.27g/ml和1.17±0.27ng/mg pro(P<0.05)。3.血和小肠组织DAO含量的变化：MODS时模型组血DAO含量是23.83±3.39mg/ml,明显高于对照组6.21±1.90mg/ml(P<0.01);模型组肠组织中DAO含量是4.84

13、±1.88mg/ml pro,明显低于对照组14.24±2.90mg/ml(P<0.01)。4.血液中XOD、MDA和GSH的变化：模型组血液中XOD和MDA含量分别是130.64±14.43U/L 和14.46±2.41nmoL/ml,明显高于对照组77.99±14.75U/L和 3.16±0.27nmoL/ml(P<0.01) ，而模型组血GSH含量是1.03±0.45g/ml,明显低于对照组3.45±0.34g/ml(P<0. 01)。5.肠组织中XOD、MDA和GSH含量的变化：模型组肠组

14、织中XOD和MDA含量分别是160.83±10.08U/g pro和17.06±1.08nmol/mg pro,均明显高于对照组的83.93±3.06U/g和12.83±2.46nmol/mg(P<0.01);模型组肠组织GSH含量是1.53±0.19g/mg pro,比对照组 3.86±0.58g/mg明显减少(P<0.01)。6.肠粘膜的形态学变化：与对照组相比较，光镜和电镜下均见模型组出现明显病理损害。7.肠粘膜通透性和肠细胞渗透性的改变：在MODS大鼠肠标本中，可看到电子密度高的镧颗粒沉积在肠细胞间隙中，沿细胞周缘

15、呈线条状分布，线条粗细不尽相等，有时随细胞间隙走向呈弯曲或缠绕成不规则圈网状，有的镧颗粒可呈串珠状分布。部分标本的镧颗粒透过细胞膜进入细胞内。对照组肠标本中，肠上皮细胞间连接处、细胞外间隙和细胞内均未见有沉积的镧颗粒。8.多元直线回归分析：以外周血中内毒素水平(ET)为因变量，以门静脉血中内毒素水平(PET)、肠过氧化脂质丙二醛(IMDA)、血二胺氧化酶(BDAO)、肠二胺氧化酶(IDAO)和肠肿瘤坏死因子(ITNF)等5项指标为自变量进行多元直线回归分析，其复相关系数r=0.964 0，剩余标准差为9.929 2。方差分析表明各指标间的多元回归具有十分显著的意义。讨论一、肠道屏障损伤是导致M

16、ODS的重要环节。我们应用无菌酵母多糖制剂腹腔注射，成功地诱发了MODS10,其脏器功能与病理变化符合MODS标准4，本文重点研究了肠道屏障功能的地位和作用。1.二胺氧化酶(DAO)的变化：DAO是人类和所有哺乳动物小肠粘膜上皮绒毛中具有高度活性的细胞内酶，在组胺和多种多胺代谢中起作用。DAO活性与粘膜细胞的核酸和蛋白质合成密切相关，它能够反映肠粘膜的完整性和损伤程度9。本实验发现，MODS时肠粘膜组织中DAO活性明显降低。DAO活性与血内毒素水平、肠粘膜组织过氧化损伤情况密切相关。因此，DAO活性变化是反映肠道屏障功能状态的良好指标。2.肠粘膜组织的过氧化损伤：本实验观察到，在MODS时肠粘

17、膜组织中XOD的活性明显增高；GSH含量明显减少。由于XOD的升高，使氧自由基产生增多；而GSH含量的减少，又使生成的氧自由基不能及时清除。于是这些活性氧成分与细胞膜上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，结果导致肠组织细胞损伤的进一步加剧。本实验发现，MODS时肠组织病理学的改变为粘膜固有层上皮细胞变性、坏死、脱落、肠绒毛水肿、间隙增宽。表明肠粘膜的机械性破坏是肠道屏障损伤的重要因素。3.肠粘膜通透性的改变：本实验用硝酸镧作示踪剂，在电镜下观察肠粘膜通透性的改变。发现MODS时电子密度高的镧颗粒沿细胞周缘沉积在肠上皮细胞间隙中；在部分标本中镧颗粒透过细胞膜进入细胞内。表明MODS时肠粘膜通透性和细

18、胞膜通透性均明显增高。肠粘膜通透性的增高，使得肠粘膜屏障功能减弱，肠道中细菌和内毒素侵入体内，通过激活体内多脏器中的吞噬细胞，释放一系列具有损伤作用的多种生物活性介质，引起全身多个器官代谢功能发生改变，这在MODS的发生和发展中起着十分重要的作用。实际上在很多情况下，肠粘膜屏障功能衰竭的发生要早于其它脏器。因此 Meakins等1将肠道称之为创伤后多脏器功能衰竭的起源，Wilmore2将肠道称之为“外科应激条件下的中心器官（central organ）”。二、肠源性内毒素是MODS的重要致病因子采用大鼠腹腔内注射酵母多糖的方法，制备出非细菌感染性MODS动物模型，并测定门静脉和周围静脉血中的内

19、毒素水平。发现其含量均明显高于对照组。同时我们还测定了血清和肠组织匀浆中肿瘤坏死因子-(TNF)的含量，发现模型组明显高于对照组。相关分析还表明，肠组织中TNF含量、肠组织DAO含量、门静脉血和外周血内毒素水平之间明显相关。结果表明，肠组织过氧化损伤和TNF等细胞因子的释放造成了肠道屏障的损伤和破坏，使大量内毒素由肠壁吸收入门静脉，造成门静脉内毒素血症，再经肝脏进入体循环产生内毒素血症。机体单核-巨噬细胞系统受到过度或持续的活化和刺激，进而导致产生、表达和释放过多的细胞因子及其它产物，通过细胞因子连锁反应和毒性网络，不仅可导致机体代谢与血液动力学异常，其持续存在还可造成自身组织、细胞结构和功能的广泛损害，最终会引起宿主脓毒性反应和MODS。而细菌内毒素或脂多糖(LPS)是这个连锁反应中最重要的诱发因素。肠匀浆中TNF代表着肠组织中巨噬细胞受内毒素攻击而释放的细胞相关性TNF水平，它除了通过内分泌作用进入血循环产生远隔器官损害外，还可通过旁分泌形式