实验生化试验pcr

1、 实验实验16 16 PCRPCR与酶切与酶切 一、实验目的一、实验目的掌握掌握PCRPCR技术原理与技术技术原理与技术 掌握限制性内切酶技术。掌握限制性内切酶技术。二、二、 实验原理实验原理3 Concepts3 Concepts of of the the PCRPCR1. 1.DenaturationDenaturation : 变性变性2. 2.RenaturationRenaturation：复性复性3. Semiconservative replicationSemiconservative replication：半保留复制半保留复制the double strand DNA o

2、pen to single stranded DNAtwo single stranded DNA form double strand DNAreplication, one make twoPCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解

3、旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明n1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便

4、可克隆tRNA基因。n但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明n1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）n基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制n最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错n耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪n1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 “I do my b

5、est I do my best thinking while driving”thinking while driving”1993 Nobel prize 引物引物引物引物引物引物XX()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR

6、过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2D

7、NA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点n灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.能从100万个细胞中检出一个靶细胞3.病毒检测的灵敏度可达3个

8、RFU4.细菌检测的最小检出率为3个细菌n简便、快速1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增2.扩增产物一般用电泳分析n对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA3 PCR的类型和应用 研究基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医犯罪现场标本分析 肿瘤各种肿瘤检测 其他 已知靶基因片段两测的序列 人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片 逆转录酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增55A正常人A病 人病原微生物基因正常人

9、 (-)病 人 (+)A探针杂交NC膜探针 HLA系统基因分型 现 嫌1 嫌2 嫌3 实时荧光定量实时荧光定量PCR仪仪梯度梯度PCR仪仪普通普通PCR仪仪 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 无扩增产物1.1. 模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2. BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3. 引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解4.4. 反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短 原原因因对对策策1.1. 纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2

10、.2. 更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3. 重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物4.4. 降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无； 非特异性扩增 现象：现象：PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高

11、3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。 M 1 21.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不

12、合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高退火温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和和镁离子镁离子的的浓度浓度6.6.减少循环次数减少循环次数 拖尾 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况) ) 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 对策：

13、1. 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。及加样枪头等均应一次性使用。3.3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 巢式巢式PCR（Nest-PCR） 递减递减PCR（TouchDown PCR） 热启动热启动PCR（HotStart PCR） 使用使用PCR增强剂增强剂巢式巢式PCR（Nest-PCR）P1P

14、2P3P4 巢式巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。套引物都互补的靶序列很少。 巢式巢式PCR可以增加有限量靶序列可以增加有限量靶序列（如稀有如稀有mRNA）的灵敏度，的灵敏度，并且提高了困难并且提高了困难PCR（如如5 RACE）的特异性。）的特异性。 递减递减PCR（TouchDown PCR） 递减递减PCR通过在通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的特异性。循环设在比估算的TmTm高大约高大约5的退火温度下开始，的退火温度下开始，然后

15、每个循环降低然后每个循环降低1 1-2 2, ,直到退火温度低于直到退火温度低于Tm Tm 5。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。循环中继续扩增占据优势。 递减递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。指纹分析等。热启动热启动PCR （HotStart PCR） 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，合成，直到直到PCR 仪达到变性温度；仪达到变性温度

16、； 现在有很多公司都有现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用； 热启动热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高是除了好的引物设计之外，提高PCR特异特异性最重要的方法之一。性最重要的方法之一。使用使用PCR增强剂增强剂 甲酰胺，甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助助DNA聚合酶延伸通过二级结构区聚合酶延伸通过二级结构

17、区。 增强剂浓度要适当增强剂浓度要适当 Lambda DNA/EcoRI+HindIII MarkerLambda DNA/EcoRI+HindIII Marker实验原理实验原理n限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链异位点上，并切割双链DNA。限制性核酸内切酶“分子手术刀”分布：分布：主要在原核生物中主要在原核生物中作用特点：作用特点： DNA重组技术的基本工具 限制性核酸内切酶EcoRI限限制酶制酶切点：切点：磷酸二酯键磷酸二酯键 .切点：磷酸二磷酸二

18、酯键酯键3.结果： 黏性末端和平末端 命名是根据分离出此酶的微生物学名而定的。即取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示。 如：EcoRI中的E表示大肠杆菌属名第一个字母，co表示种名头两个字母，R表示株名，I表示该菌中第一个被分离出的酶。命名和分类常用限制酶的种类及切割方式限制性内切限制性内切酶酶酶分子酶分子识别位点识别位点切割位点切割位点 限制作用是限制作用是否需用否需用 ATP类类 三 亚 基 双三 亚 基 双功能酶功能酶 二分非对称二分非对称至少在识别至少在识别位点外位点外 1000bpYes类类内切酶与甲内切酶与甲基化酶分子基化酶分子不在一起不在一起4-6b

19、p, 大多大多数为回文对数为回文对称结构称结构 在识别位点在识别位点中或靠近识中或靠近识别位点无特别位点无特异性异性No类类二亚基双功二亚基双功能酶能酶 5-7 bp 非对非对称称在识别位点在识别位点下 游下 游 2 4 -26bpYes限制性内切酶可分为三类限制性内切酶可分为三类类类限制性内切酶限制性内切酶 类酶切割位点在识别序列中类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切有的在对称轴处切割割, 产生平末端的产生平末端的DNA片段片段(如如Sma: 5-CCCGGG-3)；有的切割位点在对称轴一侧有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出产生带有单链突出末端的末端的DNA片段称粘性末端片段称

20、粘性末端，如如EcoR切割识别序列切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。后产生两个互补的粘性末端。 5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 DNA连接酶“分子缝合针”DNA连接酶“分子缝合针”DNA 1g反应反应 10缓冲液缓冲液2L重蒸水重蒸水19L1L酶液酶液+用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底混匀反应体系后，混匀反应体系后，37水浴保温水浴保温2-3h每管加入每管加入2L 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，电泳检测，电泳检测EP管编号管编号, 加样加样实验步骤实验步骤对质粒对质粒DNA酶切

21、反应酶切反应 限制性内切酶用量可按标准体系限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加加1单位酶单位酶, 消化消化1-2h。但要完全酶解。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。至更多，反应时间也要适当延长。 电泳检测示例电泳检测示例实验注意事项实验注意事项1.限制性内切酶用量可按标准体系限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加加1单位酶，消化单位酶，消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。反应时间也要适当延长

22、。 2.酶切时所加的酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分溶液中其他成分会干扰酶反应。会干扰酶反应。 3.许多实验制备的许多实验制备的DNA不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。可能干扰随后的反应。 4.市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（缓冲液（1）进行稀释。另外，酶通常保存在）进行稀释。另

23、外，酶通常保存在50%的甘油中，实的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影之下，否则酶活性将受影响。响。 1基因表达载体的组成基因表达载体的组成DUCK179制作a、目的基因、目的基因 b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因抗生素抗性基因方法方法导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子重组子筛选方法n遗传检测法n物理检测法n菌落原位杂交法n免

24、疫化学检测法n测序n菌落PCRn遗传检测法 （1）抗药性记号插入失活选择法 n（2） -半乳糖苷酶显色法筛选重组子 菌落原位杂交n提取质粒酶切法需要提取质粒,当筛选的样品较多时,操作比较繁琐； 蓝白斑筛选法需要载体有特殊结构; 杂交筛选法除操作比较复杂外,尚需使用同位素;插入失活法仅适用于个别载体。 n菌落PCR ：是直接以转化菌的单个克隆为模板,通过特异性引物或通用引物对插入载体中的目的基因快速扩增，用于鉴定和筛选阳性转化菌的技术。n与传统的鉴定方法相比,由于其具有快速、经济、简便的特点而被广泛用于转化菌、特别是大量转化子的鉴定和筛选 。lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解分解乳糖乳糖iPO调

25、控蛋白调控蛋白P大肠杆菌的大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ系统系统a-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ -半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解乳糖分解乳糖iPO调控蛋白调控蛋白P-肽段肽段分解分解X-gal产物呈现蓝色产物呈现蓝色诱导剂诱导剂IPTG-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突变体突变体M15TH 基因的基因的PCR扩增扩增 在在0.5ml Eppendorf管中加入：管中加入：ddH2O 15l10PCR Buffer 2.0ldNTP （10 mM） 1lprimer 1(10pmol/l) 0.5lprimer 2 (10pmol/l) 0.

26、5l模板DNA 0.5lTaq酶（5U/l） 0.5l Total 20l酪氨酸羟化酶 英文名称：英文名称：tyrosine hydroxylase;TH 编号：EC 1.14.16.2。催化儿茶酚胺生物合成的第一步(为限速步)，即将L-酪氨酸转变成3，4-二羟-L-苯丙氨酸(L-DOPA)的羟化酶。在帕金森病中起重要作用。循环参数循环参数n1、预变性（Initial denaturation） 模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95加热3-5分 钟。 n2、引物退火（Primer annealing） 退火温度一般需要凭实验（经验）决定。 退火温度对PCR的特异性 有较大影响。

27、 n3、引物延伸 引物延伸一般在72进行（Taq酶最适温度）。延伸时间随扩增片段长短及所使用Taq酶的扩增效率而定。 n4、循环中的变性步骤 循环中一般95，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 n5、循环数 大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。 n6、最后延伸 在最后一个循环后，反应在72维持5-15分钟使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 25个循环反应程序为：94 4min94 30s66 45s72 1min20s 72 10min4 30min注意事项注意事项n1. PCR反应应该在一个没有DNA和核

28、酸酶污染的干净环境中进行。n2. PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。n3. 分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA。n4. PCR试剂配制应使用最高质量的高压灭菌新鲜双蒸水；试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。n5. 操作过程中均应戴手套，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。n6. 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。n7. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTPs、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，最后加入反应模板，加入后盖紧反应管。这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。n8. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性。Ec