高抗菌活性乳酸菌的筛选及菌种鉴定

1、高 抗 菌 活 性 乳 酸 菌 的 筛 选 及 菌 种 鉴 定摘 要：研究旨在筛选适用于饲料青贮的高抗菌活性乳酸菌，并进行菌种鉴定。以藤黄微球菌、沙门氏菌、大肠杆菌为指示菌，通过牛津杯双层平板法对从玉米、水稻、蔬菜残渣、猪粪、鸡粪等样品中分离出的121株乳酸菌进行抑菌试验。通过生理生化，碳源发酵试验和16SrRNA分子鉴定及recA基因扩增对所选菌株进行鉴定。菌株ZZU 575具有较强抗菌活性，排除酸、过氧化氢干扰后，其发酵上清液对大肠杆菌抑制作用消失，但对藤黄微球菌及沙门氏菌仍有很强的抑制活性；其抑菌活性在酸性条件下较强，在加入蛋白酶K和胰蛋白酶以及100 以上热处理时明显下降甚至消失；ZZ

2、U 575被鉴定为植物乳杆菌。菌株ZZU 575在饲料青贮中具有潜在应用价值。关键词：乳酸菌；抑菌活性；16S rRNA；recA乳酸菌是一种广泛分布于自然界而且普遍应用于食品、医药、饲料等领域的益生菌。乳酸菌可以产生多种抑菌物质，包括有机酸，过氧化氢及细菌素等；其中细菌素是由微生物通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的蛋白类物质，抑菌范围不仅仅局限于同源的细菌，产生菌对其细菌素具有自身免疫性。细菌素与抗生素不同，一些抗生素杀死病原微生物的同时，还会破坏动物肠道正常菌群，导致菌群失调、抵抗力下降，疾病的发病率增加等不良情况。而乳酸菌产生的细菌素因其具有无毒性，无抗药性，易被消化道中的蛋白酶

3、降解，不易在体内蓄积引起不良反应等特性，已经引起开发高效安全饲料添加剂科研人员的密切关注1-5。细菌素可防止饲料本身被沙门氏菌等致病菌的污染，防止致病菌对动物的危害，并且可限制带菌动物排泻物中病原微生物的传播。我国农业部第105号公布的允许使用的饲料级微生物添加剂共12种，植物乳杆菌是其中的一种；菌体本身与所产植物乳杆菌素在饲料中主要应用于青贮饲料、微生物发酵饲料及饲料添加剂等方面6-7。尽管乳酸菌在饲料青贮中已有所应用，但由于饲料种类繁多，分布区域环境条件差异较大，仍然需要广泛筛选优良乳酸菌，开发新的适合具体需求的高效饲料青贮用乳酸菌添加剂。分离筛选高抗菌活性的乳酸菌，不仅有利于饲料青贮，还

4、可以应用于食品、饲料的杀菌防腐和微生态制剂的研究开发。本实验筛选出一株抑菌活性较强的乳酸菌，并对其生物学特性进行研究，旨在为这一菌株作为饲料青贮添加剂的开发应用提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验菌株乳酸菌菌株共121株，分离自玉米、水稻、蔬菜残渣、猪粪、鸡粪等样品；指示菌有藤黄微球菌、大肠杆菌、沙门氏菌，均为实验室保存。1.1.2 试剂及培养基过氧化氢酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、菌株DNA提取试剂盒、MRS培养基、NA培养基。1.2 方法1.2.1 高抗菌活性菌株的初筛将保存于-80 冰箱中的乳酸菌活化后，接种到MRS 液体培养基，30 培养48 h。发酵液经 10 000

5、r/min离心5 min，取上清液用于高抗菌活性乳酸菌的筛选；采用牛津杯双层平板法8测定其抑菌活性。1.2.2 产细菌素菌株的复筛乳酸菌在生长过程中会产生许多具有抑菌作用的物质，如有机酸、过氧化氢等，因此在筛选细菌素产生菌时需要排除这些因素的干扰，并初步确定其抑菌物质是蛋白质类物质。 酸抑制作用的排除：选取对三种指示菌均有抑制作用的菌株，按上诉方法制备发酵上清液，测上清液的pH值，用2 mol/l NaOH和2 mol/l乳酸调发酵上清液pH值至5.0，并用乳酸调未接种的MRS液体培养基pH值至5.0作为对照；用牛津杯双层平板法做抑菌实验。 过氧化氢酶作用的排除：选取酸排除后依然有抑菌作用的乳

6、酸菌菌株制备发酵上清液，调pH值至7.0，按照过氧化氢酶终浓度为5.0 mg/ml加入到发酵液中，37 水浴2 h，再将pH值调至5.0，检测过氧化氢酶处理后发酵上清液的抑菌活性。 蛋白酶解检测：选取筛选出的乳酸菌制备发酵上清液，调发酵上清液到胰蛋白酶和蛋白酶K的最适作用pH值，按1.0 mg/ml加入胰蛋白酶和蛋白酶K，同上处理，检测胰蛋白酶和蛋白酶K对乳酸菌发酵上清液抑菌活性的影响。1.2.3 细菌素生物学特性初步鉴定 热敏感性：将发酵上清液分别置 60、80、100 水浴锅 30 min 和 60 min，121 灭菌锅15 min；冷却后进行抑菌实验。 pH敏感性：发酵上清液，用1 m

7、ol/l 乳酸和1 mol/l NaOH 调其pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，37 温育2 h后，进行抑菌实验。1.2.4 产细菌素乳酸菌的鉴定 菌株表型特征及生理生化实验：观察培养皿上菌落的形状、颜色、大小等，用革兰氏染色后观察细胞的形态。生理生化实验包括观察不同温度、pH值、盐(NaCl)浓度条件下的生长状况、过氧化氢酶实验、葡萄糖产气实验，碳源发酵实验9。 16S rRNA基因PCR产物片段的DNA序列分析10。 细菌基因组的recA扩增11-12。2 结果与分析2.1 初筛结果对实验室保存的121株乳酸菌进行抑菌实验，发现有45株对三种指示菌

8、有较强的抑制作用。选取这45株菌进行复筛实验。乳酸菌属于G+菌，传统观点认为G+菌的抑菌范围仅限于其他G+菌，但后来发现一些G+菌所产细菌素的抑菌谱可以显著扩大，对一些G-菌也有抑制作用13。本实验筛选出一些乳酸菌菌株对G+菌和G-菌均有抑制作用。2.2 复筛结果经过酸排除、过氧化氢排除实验，从猪粪中分离出的编号为 ZZU 575的乳酸菌抑菌活性较强，其发酵上清液在不同条件下对指示菌的抑菌活性如表1所示，pH值调至5.0的MRS液体培养基对三种指示菌都没有抑制作用，说明这三种指示菌可以耐受pH值5.0的环境。在排除酸的作用后，菌株 ZZU 575 的上清液对大肠杆菌的抑制作用消失。但排除酸和过

9、氧化氢作用后，菌株ZZU 575对藤黄微球菌及沙门氏菌仍具有较强的抑制活性，说明该菌株发酵上清液中存在除酸和过氧化氢以外的其它抑菌物质。表1 ZZU 575的抑菌效果试验菌株ZZU575ZZU575ZZU575ZZU575MRS抑菌活性藤黄微球菌+-+-大肠杆菌-沙门氏菌+-注：抑菌圈直径包含牛津杯外径（7.80 mm）；+：抑菌圈直径8.0012.00 mm；+：12.0016.00 mm；+:16.0020.00 mm；-：表示无抑制作用（直径8.00 mm），表2、表3同；代表酸排除处理；代表过氧化氢酶处理；代表蛋白酶K处理；代表胰蛋白酶处理。将菌株ZZU 575的发酵上清液进行胰蛋白酶

10、和蛋白酶K的酶解实验，发现在加入胰蛋白酶后抑菌活性微弱，加入蛋白酶K后的抑菌活性消失，说明菌株ZZU 575发酵上清液中存在细菌素类抑菌物质。2.3 细菌素生物学特性的初步鉴定2.3.1 热敏感性菌株ZZU 575发酵上清液在不同温度处理下的抑菌效果如表2所示，菌株ZZU 575 产生的细菌素表现出较好的热稳定性。在60 和80 条件下热处理30 min和60 min，抑菌活性基本保持14不变，说明在低于或等于80 条件下该抑菌活性B艺设备工D道健康肠E机微量元素有A家论坛专F刍动物营养反G济动物经H测技术检I题论述专SILIAO GONGYEC验研究试物质稳定性较强。但随着温度继续升高，其活

11、性受到影响，在100 条件下处理30 min或60 min,活性有所减弱，在121 处理15 min后，抑菌活性消失。指示菌沙门氏菌藤黄微球菌加热处理后的抑菌活性60 30 min+60 min+80 30 min+60 min+100 30 min+60 min+121 15 min-表2 温度对细菌素抑菌活性的影响指示菌沙门氏菌藤黄微球菌抑菌活性pH值2.0+3.0+4.0+5.0+6.0+7.0-8.0-9.0-表3 pH值对抑菌活性的影响实验菌株ZZU 575革兰氏染色+细胞形态杆发酵类型同型生长温度（）5w10+40+45w50w可适生长pH值3.0+3.5+4.0+4.5+5.0+

12、6.0+7.0+8.0+9.0+NaCl 浓度（%）3.5+6.5+葡萄糖产气-过氧化氢酶-表4 菌株形态及生理生化特性鉴定结果注：+：代表反应为阳性；-：代表反应为阴性；w：代表反应为弱阳性。表5同。2.4.1 菌落形态菌落呈圆形，颜色为乳白色，不透明，表面光滑，边缘整齐。2.4.2 菌株的形态及生理生化特性（见表4）2.3.2 pH敏感性将菌株ZZU 575的发酵上清液调至不同的pH值后分别进行抑菌实验，抑菌效果如表3所示。表3结果表明，在pH值2.06.0范围内，菌株ZZU 575的发酵上清液对沙门氏菌和藤黄微球菌均有抑制作用；当pH值7.0时，菌株产生的细菌素基本无抑菌活性。2.4 菌

13、株ZZU 575的鉴定由表4可以看出，菌株ZZU 575可以在10 低温下生长良好，而对45 、50 高温及5 低温的耐受能力微弱；可以在pH值3.09.0的范围内生长良好；可以耐受3.5%及6.5%的盐浓度。2.4.3 碳源发酵实验结果（见表5）由表5可知，菌株ZZU 575 可以利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇等18种碳源，对拢牛儿糖、D-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐有微弱利用。2.4.4 16S rRNA序列分析将测得的16S rDNA序列与通过Blast在GenBank 中检测得到的标准菌株序列信息通过CLUSTAL W软件比对。采用邻接法构建进化树（neighbor-join

14、ing method），如图1所示，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis被用作外围菌株。根据菌株的生理生化性状，和其在系统进化树上的位置，将菌株ZZU 575初步鉴定属于植物乳杆菌群。将其和4株标准菌株L. plantarum subsp. plantarum，L. plantarum subsp. argentoratensis，L. pentosus，L. paraplantarum进行recA基因部分扩增产物的比对。结果如图2所示。菌株ZZU 575和标准菌株植物乳杆菌一样具有相同的recA基因扩增产物（318 bp）。因此ZZU 575被鉴定为植物乳杆菌(L. plantar

15、um subsp. plantarum)。3 讨论对实验室保存的乳酸菌进行抑菌活性实验后，筛选到一株有较强抑菌活性的乳酸菌菌株ZZU 575，这株乳酸菌在排除有机酸和过氧化氢的作用后仍有抗菌活性，而蛋白酶K，胰蛋白酶的作用可以使其抑菌活性明显下降甚至丧失，这与已报道的细菌素Sakacin C214情况类似，初步说明菌株ZZU 575产生的是蛋白类抑菌物质，有可能是一类细菌素。决定细菌素应用价值的关键因素是 15B艺设备工D道健康肠E机微量元素有A家论坛专F刍动物营养反G济动物经H测技术检I题论述专2013年第34卷第19期 总第448期C验研究试编号0123456789101112131415

16、161718192021222324碳源对照甘油赤癣醇D-阿拉伯糖L-阿拉伯糖核糖D-木糖L-木糖阿东醇-甲基-D-木糖甙半乳糖葡萄糖果糖甘露糖山梨糖鼠李糖卫茅醇肌醇甘露醇山梨醇-甲基-D-甘露糖甙-甲基-D-葡萄糖甙N-乙酰-葡糖胺苦杏仁甙熊果甙结果-+-+-+-+编号25262728293031323334353637383940414243444546474849碳源七叶灵柳醇纤维二糖麦芽糖乳糖蜜二糖蔗糖海藻糖菊糖松三糖棉籽糖淀粉糖原木糖醇拢牛儿糖D-松二糖D-来苏糖D-塔塔糖D-岩糖L-岩糖D-阿拉伯糖醇L-阿拉伯糖醇葡萄糖酸盐2-酮基-葡萄糖酸盐5-酮基-葡萄糖酸盐结果+-+-w-w

17、-w-表5 碳源发酵实验结果16图1 ZZU 575的16S rRNA基因序列系统进化树B艺设备工D道健康肠E机微量元素有A家论坛专F刍动物营养反G济动物经H测技术检I题论述专SILIAO GONGYEC验研究试细菌素的稳定性，因其结构和性质的不同，各类细菌素的稳定性不一样。细菌素的稳定性主要受到温度和pH值的影响，对温度而言，不同的细菌素对温度的敏感性不同，本实验筛选的菌株ZZU 575的抑菌物质在6080 高温处理后抑菌作用基本保持稳定。温度高于 100 时抑菌活性明显降低，推测原因可能是高温使多肽或者蛋白质的高级构象和空间结构发生变化，导致多肽或蛋白质失活，从而使得细菌素活性降低。对pH

18、值而言，大部分细菌素在酸性条件下稳定，在中性和碱性条件下活性降低或失活，菌株ZZU 575产生的抑菌物质在酸性条件下活性较强，表明其抑菌物质可以在弱酸性的青贮饲料中发挥作用。注：M代表DNA marker；1、2、3、4、5分别代表L. case（i阴性对照），L. paraplantarum，L. pentosus，L. plantarum subsp. plantarum, L. plantarum subsp. argentoratensis 的扩增产物；6代表待测菌株ZZU 575的扩增产物。图2 recA基因扩增产物分析在对菌株ZZU 575进行鉴定中发现单凭该菌株的生理生化，碳源发

19、酵特征很难将其鉴定到种的水平。通过16S rRNA序列分析，发现ZZU 575归于Lactobacillus属，但不能明确鉴定到种，因此又补充了recA基因扩增产物分析。结果显示菌株ZZU 575 属 于 植 物 乳 杆 菌 (L. plantarum subsp.plantarum)。菌株ZZU 575所产抑菌物质的分离纯化及作用机理等有待进一步研究。4 结论本研究筛选到一株高抗菌活性乳酸菌，对G+菌和G-菌均有抑制作用，且其产生的抑菌物质在酸性条件下活性较强，在6080 高温范围内活性稳定。该菌在1040 、pH值3.09.0环境中生长良好，能够耐受6.5%的盐浓度。以上结果表明该菌株在青

20、贮饲料中具有潜在应用价值。参考文献1 田召芳，牛钟相, 常维山，等. 乳酸菌细菌素的研究进展J.徽生物学杂志，2003，23(6): 47-49.2 张艾青，刘书亮，詹莉，等. 产广谱细菌素乳酸菌的筛选J.中国酿造, 2007, 167(2): 45-48.3 王成涛，曹雁平，孙宝国，等. 产类细菌素乳酸菌的筛选及其生物学特性研究J. 中国酿造, 2008, 200(23):50-53.4 韩雪，李研东，王颖. 产细菌素乳酸菌的分离与筛选J. 中国饲料, 2011(7):31-32.5 储卫华，曹映海，高国峰. 筛选产类细菌素乳酸菌及类细菌素特性研究J. 微生物学杂志, 2006, 26(1)

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