番鸭呼肠孤病毒和H9亚型禽流感病毒共感染对番鸭法氏囊和抗体产生的影响.docx

1、第34卷第2期2012年2月中国预防兽医学报ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineVol.34,No.2Feb.2012doi:103969/j.issn,10080589.2012.02.13番鸭呼肠孤病毒和H9亚型禽流感病毒共感染对番鸭法氏囊和抗体产生的影响林锋强'2,陈少莺】，2二朱小丽】，2,程晓霞王劭L2,陈仕龙心，蔡羲I,李兆龙I,马春全3,赵佳荣3(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州350013;2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建福州350013;3.佛山科技学院生命科学学院，广东佛山528231)摘要

2、：为探讨番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和H9亚型禽流感病毒(H9AIV)共感染对番鸭法氏囊免疫应答能力的影响，本研究将MDRV或/和H9AIV人工感染8日龄番鸭，观察法氏囊病理组织学变化，检测法氏囊B细胞增殖能力及RE-5AIV疫苗免疫后抗体变化规律。结果显示：H9AIV感染组番鸭发病率低(10%),无死亡，法氏囊无病理变化，显著抑制番鸭法氏囊细胞增殖反应；MDRV感染番鸭发病率70%,死亡率40%,生长迟缓，法氏囊病理变化为萎缩，淋巴细胞减少，局部出现范围较小的坏死灶，番鸭法氏囊细胞增殖反应下降；共感染组番鸭发病率100%,死亡率80%,番鸭生长迟缓，法氏囊萎缩和淋巴细胞增殖反应下降程度均比单一

3、病毒感染组严重。病毒感染使番鸭对RE-5AIV疫苗免疫应答能力明显下降，其共感染组抑制抗体应答程度最严重；共感染组的病毒检出时间早于并且检出率大于单一病毒感染组。表明MDRV与H9AIV共感染在番鸭免疫应答抑制方面有协同作用。关键词：番鸭呼肠孤病毒；H9流感病毒；法氏囊；免疫抑制中图分类号：S855.3文献标识码：A文章编号：10080589(2012)02.0133.05Influenceofco-infectionwithmuscovyduckreovirusandH9avianinfluenzavirusonbursaandantibodyresponseinmuscovyducksLI

4、NFeng-qiangLCHENShao-yinguZHUXiao-li12,CHENGXiao-xia12,WANGShao%CHENShi-long1,2,CAIXi1,LIZhao-long1,MAChun-quan3,ZHAOJia-rong3(1.InstituteofAnimalHusbandlyandVeterinaryMedicine,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350013,China;2.FujianAnimalDiseasesControlTechnologyDevelopmentCenter,Fuzhou35001

5、3,China;3.CollegeofLifeScience,FoshanUniversity,Foshan528231,China)Abstract:Toinvestigatethepathogenicityandimmuneresponseofmuscovyduckstoco-infectionofmuscovyduckreovirus(MDRV)andH9subtypeavianinflunenzavirus(AIV),cight-dayoldmuscovyducksweredividedinto3groupsandartificiallyinfectedwithMDRV,H9subty

6、peAIValoneorboth,respectively.Thepathogenicityoftheviruseswereevaluatedbyhistopathologicexaminationofthebursaandproliferationabilityofbursacell,andantibodyresponsesweretestedinsomeofmuscovyducksfromeachgroupwhichimmunizedwithH5N1subtypeRc5AIVvaccinepostthevirusinfection.Theresultsshownthatthemorbidi

7、tyofduckswaslow(10%)andnodeathinAIVinfectedgroup,butproliferationabilityofbursacellswereobviouslysuppressed.DucksinfectedwithMDRVcaused70%morbidityand40%mortality.Moreover,co-infectionwasinducedCorrespondingauthor收稿日期：2011-08-14基金项目：福建省自然科学基金项目(2008J0061)；国家自然科学基金(30771620)作者简介：林锋强(1976-),男，福建福州人，副研

8、究员，主要从事畜禽传染病和分子生物学研究.*通信作者：E-mail:chensy58seriouslytheimmunesuppressionandcaused100%morbidityand80%mortality.ProliferationabilityofbursacellsandimmuneresponsestoRe-5AIVvaccinewasalsomoreobviouslysuppressedthanthatofothergroupsandtheviruslastedlongerinducksthanthatofAIVandMDRVinfectionalone.Aboveall,

9、infectionwithH9AIVwasabletoaggravatetheimmunosuppressionduetoMDRVinfection,therefore,co-infectionofMDRVandH9AIVhadsynergyeffectondepressingimmuneresponses.OurdaliirevealedthatMDRVplayedanimportantroleintheoccurrenceandepidemicofwaterfowlinfluenza.Keywords：muscovyduckreovirus;H9avianinfluncnzavirus;b

10、ursa;immunosuppression番鸭呼肠孤病毒病（Muscovyduckreovirusis,MDR）和水禽流感（Avianinfluenza,Al）均是近年新出现的严重阻碍水禽饲养业健康发展的重要传染病叫国内福建、广东和浙江等省份自1997年以来一直有MDR发生的报道，1998年以来水禽也由禽流感病毒（AIV）的携带者和贮存宿主转变为AIV的高度易感宿主队】。番鸭呼肠孤病毒（MDRV）为免疫抑制性病毒，感染后引起水禽免疫器官坏死或萎缩等病变，对免疫功能有抑制作用昭。H9N2亚型AIV广泛存在于世界各地，我国1994年在鸡中首次发现H9N2亚型AIV,目前绝大部分省市区均有H9亚型

11、AIV流行，某些地区的养殖场H9AIV阳性率达到90%以上皿】。近年来研究发现H9AIV能够引起鸡和鸭的免疫抑制，。1。因此，探讨MDRV和AIV共感染情况下法氏囊形态和功能变化过程，为今后MDR和AI临床免疫预防程序的制定奠定基础。1材料和方法1.1病毒株MDRV强毒（MW9710株）和H9亚型AIV均由本实验室分离、鉴定并保存。1.2实验动物1日龄未免疫任何疫苗雏番鸭购自莆田广东温氏家禽有限公司。1.3主要试剂RPMI1640购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；LPS和MTT购自Sigma公司，分别用RPMI1640配成1mg/mL和5mg/mL冷冻保存备用；淋巴细胞分离液

12、购自上海恒信化学试剂有限公司；重组AIV灭活疫苗（H5N1亚型、Re-5株）由肇庆大华农生物药品有限公司生产（批号200801）;AIVH5亚型HI抗原和阳性血清购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。1.4实验分组及设计200羽8日龄番鸭分为对照组（35羽）、H9A1V组（35羽）、MDRV（65羽）、MDRV+AIV组（65羽）。对照组注射0.2mLHankes；H9AIV组以鸡胚尿囊液感染0.3mL/羽（口服0.2rnL+腿肌注射0.1mL）（l（TTClDJ羽）;MDRV组以I:50稀释的病毒原液腿肌注射感染0.2mL/羽（10杼TCIDJ羽）,MDRV+AIV蛆按上叙剂量同时感染MDRV

13、和H9AIV。感染后各组番鸭隔离饲养，每组取10羽每天观察并记录发病死亡情况。每组分别于感染后7d和21d各取15羽按照重组AIV火活疫苗说明书免疫AIV灭活疫苗，（）.5mL/羽c1.5病毒感染对法氏囊重量的影响各组番鸭在感染后7d和14d称量体重及其法氏囊的重量,1.6病毒感染对法氏囊组织损伤的影响感染后5d、7d、10d无菌采集法氏囊，称重后以中性福尔马林固定，石蜡切片，HE染色，观察病理组织学变化.1.7病毒感染对法氏囊细胞增殖的影响感染后7d、14d、21d和28d,无菌采集法氏囊，分离法氏囊淋巴细胞，调整细胞浓度为5x1（?个/mL。试驱孔每孔加50叫细胞悬液和50piL20pig

14、/mLLPS,对照孔加50头L细胞悬液和50jiLRPMI1640完全培养基，均设3个重复,并设RPM11640空白孑L40C5%CO2培养60h,各孑L加入10|xLMTT。加150|xLDMSO溶液显色反应20min,酶标仪检测各孔ODg值。用刺激指数（S1）评价组间差异性、,SI计算方法：SI=试验孔0D5M平均值-空白孔ODg,平均值/对照孔ODsg平均值-空白孔ODg”平均伯L1.8病毒感染对AIV疫苗诱导抗体反应的影响分别于第二次免疫后7d、I4d、21d、28d采血分离血清，采用血凝抑制法（HI）测抗H5AIV抗体，比较试验组与对照组之间的差异。1.9病毒在法氏囊中的分布感染后I

15、d、3d、7d、10d、14d、21d、28d,每组分别随机选取3羽鸭无菌采集法氏囊组织，用TRIzol试剂提取病毒RNAo根据建立的RTPCR方法对样品进行MDRV检测，根据中华人民共和国农业行业标准NY/T772-2004对样品进行H9A1V检测。1%琼脂糖凝胶以出现约300bp特异扩增条带为MDRV阳性,以出现732bp特异扩增条带为H9AIV阳性。1.10数据统计分析采用MicrosoftExcel软件进行标准差和方差分析，不同组别的所有数据用f检验确定差异显著性。2.1不同感染组对番鸭发病率和死亡率的影响各组番鸭感染后观察至感染后28dAIV感染组仅个别番鸭一过性轻微发病，表现为精神

16、差、不爱动,无死亡；MDRV感染蛆的发病率为70%,死亡率为40%.表现为软脚、毛松、缩颈、拉稀、食欲下降；而共感染组发病率为100%,死亡率为80%,临床表现与MDRV组相似°表明MDRV和H9AIV共感染提高了感染番鸭的发病率和死亡率，加重了病情。健康对照组在整个试验观察期内均无异常反应（表l）o表1不同感染组番鸭发病率和死亡率Table1ThemorbidityandmortalityofmuscovyduckindifferentinfectiongroupsGroupNumberofinoculatedducksNumberofillducksNumberof网0敞剪dea

17、dducksMortalityAIVgro叩10110%00MDRVgroup10770%440%Co-infectiongroup1010100%880%Control10o0002.2不同感染组对法氏囊器官指数的影响感染AIV组番鸭法氏囊脂竹指数与健康对照组比较差异不显符；MDRV组和共感染祖番鸭法氏囊萎缩，法氏囊器官指数均降低，并且共感染组法氏囊器官指数显著低于MDRV组（/X0.05）；表明H9AIV感染不影响番鸭免疫器官的发育,MDRV对法氏囊的损伤较大，共感染组法氏囊损伤最为严重（表2）。2.3不同感染组对番鸭法氏囊的损伤程度AIV感染蛆番鸭法氏囊病理变化不明显，仅出现轻微的淋巴细

18、胞坏死和核碎裂等变化；MDRV感染组番鸭法氏囊损伤变化与共感染组相似。共感染组接种病毒Id后,法氏囊结构尚完整清晰.部分淋巴滤泡中淋巴细胞数量开始减少；接种第3d,大部分滤泡淋巴细胞坏死.数量大量减少，出现很多空腔,局部上皮细胞变性坏死；接种第5d10d,滤泡淋巴仍以淋巴细胞减少为主.局部出现范围较小的坏死灶（图1图3）。表2不同感染组对番鸭法氏囊器官指数的影响(X±SD,n=5)Table2TheeffectofdifferentinfectedwaysonindexofmuscovyducksbursaDayspostinfection(d)GroupBodyweightBurs

19、a/Bodyweight7Control152.15±18.660.232±0.018-*AIVgroup151.63±17.250.242±0.022，MDRVgroup122.56±10.880.152±0.014ACo-infcctiongroup121.35±16.240.112±0.0!114Control188.32±17.240.188±0.032*AIVgroup185.32±12.250.179±0.028-MDRVgroup152.22±14.3

20、20.133±0.012bCo-infectiongroup144.86±10.320.100±0.008":同列教据肩注不同大写字母者差异极显著(p<0.0l),标有不同小写字母者差异显著(p<0.05),肩注小写字母相同或未标出者差异不显著(p>0.05)。*:Meanswiththediflerentlettersweresignificantatthep<0.05level(a,b,c)orp<0.0l(A,B.C)level,withthesamelettersornoletterweresignificantat

21、thep>0.05level.图1健康对照组番鸭法氏囊Fig.lMuscoryduckbursaofcontrolgroiqp图2MDRV组番鸭法氏囊(HElOOx)Fig.2MuscoryduckbursaofMDRVgroup(HElOOx)图3共感染组番鸭法氏ft(IIE100x)Fig.3Muscoiyduckbursaofco-infectiongroup(HElOOx)2.4不同感染组对法氏囊B淋巴细胞增殖的影响病毒感染组番鸭法氏囊B淋巴细胞刺激指数均明显低于对照组，其中7DPI-21DPIAIV组与对照组差异显著(p<0.05);共感染组、MDRV组与对照组差异极显著

22、(p<0.01),与A【V组差异显著(p<0.05);共感染组和MDRV组差异不显著(p>0.05)o表明MDRV和H9AIV均能抑制番鸭体液免疫中枢器官法氏囊的B淋巴细胞增殖功能(表3)o表3番鸭法氏1IB淋巴细胞增殖功能变化(X土SD,n=5)Table3ThechangesofBlymphocytesproliferationofthebursainmuscovyducksGroupDayspostinfection7d14d21d28dAIVgroup1.28±0.11b1.26±0.11A1.42±0.b1.72±0.16aM

23、DRVgroup1.10±0.08"1.04±0.06*1.21±0.”1.50±0.12bCo-infectiongroup1.08±0.081.05±0.05®1.18±0.101.45±0.13'Control1.55±0.121.65±0.16,1.78±0.16,1.85±0.15a*：同列数据肩注不同大写字母者差异极显著(p<o.oi),标有不同小写字母者差异显著(p<0.05),肩注小写字母相同或未标出者差异不显著(p&g

24、t;0.05)o*Meanswiththedifferentlettersweresignificantatthep<0.05level(a,b,c)orp<0.01(A,B,C)level,withthesamelettersornoletterweresignificantatthep>0.05level.2.5不同感染组对AIV疫苗HI抗体水平的影响对照组番鸭禽流感疫苗二免后抗体效价上升，二免后14dHI效价最高，维持在9.2,随后抗体效价维持在8.0以上(表4)0而AIV感染组番鸭抗体效价上升缓慢，抗体效价显著低于对照组(p<0.05)；MDRV组番鸭二免后抗体

25、缓慢上升，二免后14dHI效价与对照组差异极显著(p<0.01),与AIV组差异显著(p<0.05);共感染组番鸭抗体效价均低于其他三组，二免后14dHI效价与对照组差异极显著(p<0.01),与AIV组差异显著(p<0.05),与MDRV组差异不显著(p>0.05)。表4H5AIV疫苗二次免疫后HI抗体水平的变化Table4Thee£fectonHIantibodytiterimmunizedbyH5AIVvaccineGroupHlantibodytiterationpost2"immunizationwithH5subtypeAIVvac

26、cine7d14d21d28dAIVgroup6.6±7.047.4±0.88b6.6±0.86b6.8±0.72bMDRVgroup5.6±5.866.0±0.72A6.4±0.78b6.6±0.76bCo-infectiongroup4.8±5.765.4±0.72A5.6±0.68A6.0±0.68AControl7.2±8.229.2±1.20"8.6±1.00a8.2±0.98,*：同列数据肩注不同大写字母者差异极显

27、著(p<0.01),标有不同小写字母者差异显著(p<0.05),肩注小写字母相同或未标出者差异不显著(p>0.05)o*Meanswiththedifferentlettersweresignificantatthep<0.05level(a,b,c)orp<0.01(A,B,C)level,withthesamelettersornoletterweresignificantatthep>0.05level.2.6不同感染组对MDRV在番鸭法氏囊分布的影响MDRV组番鸭病毒检出时间为3DPI-21DPI,共感染组番鸭病毒检出时间为1DPI-21DPIo在2

28、8DPIMDRV组和共感染组均未检测到病毒<.因此，共感染组的病毒检出时间HFMDRV单独感染组，而且检出率大于MDRV单独感染组(表5"表5MDRV组和共感染组番鸭法氏囊中MDRV分布Table5MDRVdistributioninthebursaonMDRV-andco-infectiongroupsDayspostinfectionPId3d7d1()d14d21d28dMDRVgroup0/32/32/33/32/31/30/3Co-infectiongroup1/33/32/33/33/32/3()/32.7不同感染组对H9AIV在番鸭法氏囊分布的影响H9AIV组番鸭

29、病毒检出时间为3DPI14DPI,共感染组番鸭病毒检出时间为1DPI21DPIo在21DPI后，H9AIV组番鸭不能检测到病毒；而共感染组在28DPI后才不能检测到病毒。因此，共感染组病毒检出时间早于H9AIV单独感染祖,IhjIL检出率大于H9AIV单独感染组(表6)o表6AIV组和共感染组番鸭法氏囊中H9AIV分布Table6H9AIVdistributioninthebursaofATV-andco-infectiongroupsGroupAIVgroupCo-infectiongroupDayspostinfectionId3d7d10d14d21<0/31/32/33/32/3

30、()/328d-.Nl)()/328d-.Nl)()/31/31/32/33/33/32/33讨论近年来，流行病学调查表明MDRV在我国番鸭饲养过程中普遍存在，常引起番鸭其他细菌或病毒的继发感染或并发感染，而比引起常规疫苗的免疫效果不佳。陈志胜等研究表明MDRV对雏鸭免疫器官的细胞凋亡具有诱导作用，从而引起免疫抑制叫,陈少莺研究表明MDRV感染引起免疫器官法氏囊中的部分淋巴细胞、浆细胞坏死和不同程度凋I'：,并且细胞溶解坏死形成大小不一的坏死灶并被大量增生的吞噬细胞所吞噬，淋巳细胞数量明显减少，导致番鸭免疫抑制皿叫这与本研究结果相致“本研究表明番鸭感染MDRV后，生长缓慢，法氏囊萎缩严

31、重，淋巴细胞数量减少；法氏囊细胞增殖功能降低。法氏囊中淋巴细胞数量和功能的下降引起对疫苗免疫应答的抑制C345678910111213141516H9N2AIV能够造成雏鸡免疫抑制。H9亚型AIV人工感染罗曼蛋鸡，在免疫器官中仅引起法氏囊部分淋巴滤泡髓质区内的淋巴细胞轻度减少，表明幼龄肉鸡感染H9N2A1V可以产生免疫抑制凹。人工感染的普通蛋鸡免疫器官中仅引起法氏囊部分淋巴滤泡髓质区的淋巴细胞轻度减少网。H9N2亚型AIV人工感染樱桃谷肉鸭可以引起法氏囊明显的病理组织变化，表现出不同程度的水肿、出血、淤血、淋巴细胞溶解、坏死等一系列病变，导致感染鸭免疫抑制四。而本研究结果表明番鸭感染H9AIV

32、后法氏囊无明显的病理组织变化，仅出现轻微的出血，淋巴小结中的淋巴细胞坏死，核碎裂°这与李静萍的报道不一致，这可能与不同品种鸭对H9AIV易感性不同有关。但番鸭感染H9AIV后淋巴细胞增殖功能的降低引起诱导疫苗免疫后抗体能力降低，表明H9AIV能够导致番鸭不同程度免疫抑制。由于MDRV和H9AIV对法氏囊均有一定程度的免疫抑制，共感染后引发更为严重的免疫抑制。本研究表明MDRV和H9AIV共感染和单一病毒感染相比，法氏囊萎缩严重，法氏囊淋巴细胞数量明显减少，抑制B淋巴细胞的增殖能力，进一步抑制流感疫苗的免疫应答。MDRV的感染导致宿主产生免疫抑制，加重了AIV的病理发生过程或抑制了宿主

33、对流感疫苗的有效应答。因此，在临床上应重视MDRV引起的病理变化与水禽流感发生和流行之间可能存在的关系，这将有助于指导水禽流感临床免疫预防程序的制定。参考文献：1 胡奇林，陈少莺.番鸭呼肠孤病毒病研究进展J.福建畜牧兽医,2004,26(增刊)：7-9.2 Kuntz-SimonG,BlanchardP,CherbonnelM,etal.Baculovirus-expressedmuscovyduckreoviruscrCproteininducesserumneutralizingantibodiesandprotectionagainstchallengeJ.Vaccine,2002(25-26),20:3113-3122.毕英佐.H9N2亚型