牛瑟氏泰勒虫P33-P23核酸疫苗研究.docx

1、牛瑟氏泰勒虫P33-P23核酸疫苗研究李娟口，许应天L张西臣2,李建华2,张国才2，宫鹏涛2,杨举2,孟丹3(.延边大学农学院动物幽学系，吉林延吉133400,2.吉林大学畜牧兽医学院，吉林K春130062；3.吉林市动物疫病预防控制中心，吉林吉林市132013)摘要：根据牛瑟氏泰勒虫主荽表面蛋白基因p23和p33的已知序列，设计特异性引物，将克隆产物与pVAXl表达栽体连接，得到真核重组表达质牲pVAXl-p33-p23,脂质体介导其转染Heia细胞后进行表达产物的鉴定，最后进行BALB/c小鼠免疫试检。结果.目的基因在真核细胞内得到正确表达，动物免疫试验pVAXl-p33-p23核酸疫苗能

2、够提高小鼠的细胞免疫和体液免疫水平，并且pVAXl-p33-p23免疫组的免疫效果均高于pVAXl-P33和PVAX1-P23免疫组(PV0.05).从而证明，牛悬氏泰勒虫的重组pVAXl-p33-p23核酸疫苗成功构建。关键词：牛瑟氏泰粉虫；P33-P23；真核表达中图分类号：S852.7文献标识玛：A文章编号：1005-4545(2008)10-1171-03Thep33-p23DNAvaccineforTheileriasergentiincattleLIJuan12,XUYing-tian1,ZHANGXi-chcn2LIJian-hua2ZHANGGuo-cai2*,GONGPeng

3、-tao2YANGJu,MENGDan(1.DepartmentofVeterinaryMedicine,YanbianUniversityYatiji133400.Oz/wa;2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicineJilinUniversityChangchun130062,C7h泌；3.TheCenterofAnimalLoemicPreventionandControlinJilinCity132013,C/uM)Abstract：Toconstructthefusionexpressionvectorofp33-p23majorsur

4、faceproteingenesfromTheileria.ser-g，Mi,twopairsofprimerweredesignedandsynthetizedaccordingtoP33andP23genesequenceofTheileriaSer-genti,thecloningproductswereinsertedintoexpressionvectorpVAXl.HclacellsweretransfectedwiththeobtainedrecombinantcukaryonreorganizationvectorpVAXl-p33-p23.Theexpressedproduc

5、twasidentifiedbyWesternblot.FinallytheBALB/cmicewereusedforimmunisingexperiment.Resultshowedthegoalgenewascorrectlyexpressedintheeukaryoticcell.TheanimalimmunisingexperimentresultindicatedthatpVAXl-p33-p23canenhancemousescellularimmunityandthehumoralimmunitylevel,andtheimmunitygroupsimmunityeffectof

6、pVAXl-p33-p23ishigher(PV0.05)thanthatofpVAXl-P33andthepVAXl-P23immunitygroup.Conclusion：RecombinantplasmidpVAXl-p33-p23wassuccessfullyconstructed.Keywords：Theileriasergenti；P33-P23；eukaryoticexpression*Correspondingauthormail-guocaiz牛瑟氏泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫(Theileriasergenti)寄生于牛体内引起的以高热、贫血、消瘦和体表淋巴结肿大

7、为主要临床症状的一种血液原虫病F。由于近几年来经贸活动的频繁和养牛业的规模化.该病的流行区逐渐扩大，特别是该病对外地引进牛、纯种牛和改良杂种牛的危害大，已成为严重影响养牛业的疾病之一国内已收稿日期；2008-06-08基金项目：吉林省科技发展计划项目(20050703-4)作者简介：车WC1983-).女.硕士.*通信作者E-mail：guocaiz见有关该病的诊断和药物治疗方面的报道但是T.sergenti有独特的生物学特性，尚未研制出常规用于防治该病的疫苗。具有最强免疫原性的T.ser-ge”表面蛋白P33和P23是研究的热点因此本试验制备了pVAXl-p33-p23核酸疫苗.探讨了其免疫

8、效果，为该病的防治研究奠定基础。1材料与方法材料大肠杆菌DH5a、pVAXl载体菌液、Hela细胞均由吉林大学畜牧兽医学院寄生虫实验室提供;TIANprcpMiniPlasmidKit为天根公司产品；DNALigationKitVer.2.1购自宝生物1：程（大连）有限公司；pMD18-T-Simple载体、T4DNALingase、XhoT、BamH、Hindlfl、Taq酶、琼脂糖购自TaKaRa公司；DNAMaker.DAB显色剂均购自北京天为时代公司：96孔酶标板为丹麦Nunc公司产品：羊抗牛IgG-HRP和底物显色液（ABTSH?（）均为美国KPL公司产品:BALB/c小鼠购于长春宏

9、达动物公司。1.1 含目的基因真核表达载体的构建全血中DNA基因组的提取、PCR、连接、转化、质粒提取及醇切的主要方法均按常规进行，将分别克隆入pMD18-T-Simple载体的）33和p23基因片段经测序正确后.连接到用fiindni和Xho1双酶切后的pVAXl真核表达载体上,获得pVAXl-p33p23,其中|33在前.含有Hind111和BamHI酶切位点；p23在后，含有BamHI和Xho1醵切位点及终止密码子。再以同样的方法建电柬组真核表达质粒pVAXl-p33及pVAXl-p23。1.3重组质粒的大量提取和纯化将质粒pVAXl-p33、pVAXlp23及pVAXl-p33-p23

10、分别转化大肠杆萌r）II5a宿主菌.经酶切鉴定筛选阳性克隆。将阳性克隆分别接种于5mLLB培养基，37C振荡培养世夜。次日按1：100的比例扩大培养过夜c质粒祐大址提取及纯化按照分子克隆实验指导的方法进行。1.4细胞转染及蛋白表达的鉴定按照Lipo-fectamine200产品说明书分别将3种重组质粒转染Hula细胞，成功转染后，常规方法处理细胞制成SDSPAGE上样蛋白液再进行Westernblotting分析。1.5动物免疫试验将纯化后的质粒经过紫外分光光度计定量终浓度调至1g/L。体质埴为1620g的BALB/c小鼠16只随机分4组，每组1只.即pVAXlP33P23、pVAXlP33、

11、pVAXlP23试验组和pVAXl对照组。小鼠每隔2周接种1次（后肢腿部肌肉注射）.100g/R.共免疫3次。其中.分别采集免疫后0、7、M、28、12、56d血清用EL1SA方法检测抗牛瑟氏泰勒虫抗体效价。最后1次免疫后的第2周取小鼠脾脏进行牌细胞T细胞亚类记数。1.6小鼠脾T淋巴细胞的制备研磨免疫后的小鼠脾脏，加入4mLD-Hanks液.滤器过滤.离心10min：加入3ml,红细胞裂解液悬浮细胞.室温放置10min后离心10min：加入4mLI）Hanks洗涤；用1mL5%1640溶解沉淀.调整细胞数达1X10,个/ml,。1.7 T细胞亚类记数取至少2X106个淋巴细胞，加入1mL荧光洗

12、液离心35min,弃上清，用200pL荧光洗液重悬细胞；将每份细胞均分为2管,分别加入荧光标记的CD4JCD3*和CD8LCD3-单克隆抗体，混匀后4C避光放置30min：用荧光洗液洗2次：管底细胞用500荧光保存液重悬:进行流式细胞仪检测500010000个细胞中CD4LCD8+阳性细胞数。1.8 ELISA检测将免疫小鼠分别在接种后0、7、14、28、42、57d采血、分离血清，应用已建立的间接ELISA方法检测抗牛弦氏泰勒虫抗体效价，观察抗牛瑟氏泰勒虫抗体的动态变化。2结果2.1pVAXl-P33-P23融合基因重组质粒的鉴定将酶切法构建的pVAXlP33-P23重组质粒.进行PCR和酶

13、切鉴定，均发现预期大小的特异片段.说明日的片段正向插入到载体内（图1）。bp200010002图1重组质检pVAXl-P33-P23前切鉴定M：分子质虽标准；1：重组质粒pVAXbP33-P23经HindIII和切后的产物；2：重组质粒pVAXlP33P23Westernblotting分析利用牛瑟氏泰勒虫阳性血清对表达产物进行Westernblotting分析可见，在55000处出现1条特异性反应带，说明所表达的P33-P23融合蛋白能被牛瑟氏泰勒虫阳性血消所特异性识别，具有反应原性（图2）。2.2 T细胞亚类记数T细胞亚类检测结果见表U试验结果表明.pVAXlP33-P23免疫组的CDJ-

14、和CD8”T细胞亚类数量显著高于pVAXl对照组（P0.01）,pVAXl-P33和pVAXl-P23等免疫组的CDrT细胞亚类数量显著高于pVAXl对照组（PV0.01）,而CD8+T细胞亚类数*高于pVAXl对照组（P2V6640044300.29000立的间接ELISA方法检测牛瑟氏泰勒虫抗体，观察了牛瑟氏泰勒虫抗体的动态变化（表2）。从表中可以看出.各重组核酸疫苗免疫组免疫后第1周开始产生特异性抗体，抗体水平显著高于对照组，并逐渐升高。从免疫后第2周开始pVAXl-P33-P23免疫组抗体水平显著高于pVAXl-P33和pVAXl-P23免疫组，一直维持显著差异，第4周开始与pVAXl

15、-P23免疫组之间差异极显著。图2pVAXl-P33P23表达产物的Westernblotting检测结果1：空白对照;2：pVAXl-P33-P23的表达产物2.4间接ELISA测定结果将免疫小鼠分别在接种后O、7、14、28、42、57d采血、分高血清，应用所建表】重组核酸疫苗免疫小鼠牌细胞中T恫胞亚矣数量分组CD4+CD8,CDC/CD8+pVAXI-P33-P2327.83250.492417.2706土0.76161.6116pVAXl-P3326.635l0.235415.03521.68051.7635pVAXl-P2326.40330.264515.06672.80951.77

16、18pVAXl19.26101.410611.105211.57161.7344表2免疫小只瑟氏泰勘虫特异性抗体效价测定分组0d7d14d28d42d56dpVAXi-P33-P230.194O.021O.365O.0170.4390.0220.544O.O19O.585O.0230.6520.023pVAXlP330.1870.0330.352O.O12O.364O.O170.439O.O120.5090.0240.5740.023pVAXl-P230.2040.0250.3500.0120.3510.0180.398土0.0210.4570.0250.4900.0】9pVAXl0.2030

17、.024O.251O.O180.207士0.0350.2310.0190.2270.0270.2030.0333讨论本研究所选用的pVAXl质粒含有人类巨细胞病毒（CMV）启动子和增强子.以及牛生长激素（BGH）基因的转录终止序列和多聚腺昔酸化信号肽，使得转录的目的基因mRNA含有1个多聚腺昔酸尾巴.有助于维持mRNA的稳定性。该质粒为美国FDA验证，专门用DNA疫苗的研究。而DNA疫苗的有效性取决于诸多因素，而且与细菌、病旅不同寄生虫具有独特的生物学特性。因此，本研究选用真核载体pVAXl构建了牛瑟氏泰勒虫融合基因重组表达质粒pVAXl-P33-P23Westernblotting分析发现,

18、该融合基因在Hela细胞中能正确表达，但表达彼较低。在本研究中，检测小鼠T细胞亚类数扯的方法推测了对细胞免疫水平的影响。试验结果表明，pVAXl-P33、pVAXlP23和对照组在CD4，T细胞亚类数址之间无差异显著，而与pVAXl-P33-P23在CD4+T细胞亚类数埴之间差异显著ipVAXl-P33-P23在CD4+和CD8*两类T细胞亚类数址之间差异显著，该结果与体外培养试验结果相符。核酸疫苗的有效性受保护性抗原数M和免疫剂量的影响.该结果与多价DMA疫苗可能是提高有效性的一种新途径的报道相符3*：。本试验利用已建立的ELISA方法进行了不同核酸疫苗的体液免疫效果。试验结果表明.从免疫后

19、第2周开始pVAXl-P33-P23免疫组抗体水平显著高于pVAXl-P33和pVAXl-P23免疫组（PV0.05）,直维持显著差异，第4周开始与pVAXl-P23免疫组之间差异极显著（PV0.01）；而pVAXl-P33和pVAXl-P23免疫组抗体水平之间在免疫后第7周开始有显著差异（PV0.05）。该结果与报道相符W。寄生虫与细菌、病毒不同，生活史复杂，并旦不同发育阶段既有共同抗原，又有特异抗原。因此，研制一种有效的核酸疫苗，尤其是研制寄生虫病的核酸疫苗.关键是筛选多种保护性抗原，本研究结果也证实了这一点。除此之外.影响核酸疫苗有效性的因素有佐剂的应用、细胞因子的合用、接种剂量、次数及

20、途径等。本研究对该病有效核酸疫苗的进一步研究打下了基础。参考文献：口许应天，张守发.李顺玉,等.牛瑟氏泰勒虫的诊断及预防研究进展J.延边大学农学学报.1997.19（4）,271-275.2MinamiT.FujinagaT.FuruyaK,etal.Clinico-hematologicandserologicalcomparisonofJapaneseand（下转1180页）737-743.8 OuardaniM.WilsonL.JetteR.etal.MultiplexPCRfordetectionandtypingofporcinecircovirusesJJ.1ClinMicrobi

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24、lecularinieraciionsonsliorioligonucleotideniicroarraysJ.NatBioiechnol.2003.21：818-821._16jScnguptaS.OnoderaK.LaiA.clal.MoleculardvieclionandidentificationofinfluenazvirusesbyoligonucleotidernicroarrayhybridizationJJ.J(linMicrobi-ol,2003.4L4542-4550.17TownsendMB.DawsonED.MthlmannMetal.Experimentaleva

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