用射线照射的B7-1转基因细胞进行肿瘤疫苗的研究.docx

1、用射线照射的B7-1转基因细胞进行肿瘤疫苗的研究刘岩王晓民徐万海【摘要】目的探讨用放射的B71转基因细胞进行肿瘤疫苗疗法的效果。方法将重组人B7-1基因其核表达载体导入QXK-1肾细胞瘤细胞，利用转基因细胞治疗观察其抗肿瘤效果。结果转基因细胞的肿瘤原性较CAKl/Wt、CAK-l/pCDNA3组明显降低(PV0.001)。同时免疫原性明显增强，以Co照射的CAK-1/I571细胞免疫后.小鼠体内诱发了抗CAK-1/Wt的系统性、保护性免疫。用“'Cq灭活的转基因细胞作为痛苗进行实骚性治疗.能够延K小鼠的生存时间，减慢肿瘤的生K速度XAK-1/B7-1的应用提高了肿瘤治疗效果(PV0.0

2、1)。结论放射的转基因细胞及其表达的R7细胞因了可以有效地激发机体的抗肿瘤免疫应答.B71表达肿瘤细胞应用可以成为一种很有前景的肿瘤疫苗。关键词B7-1癌疫苗基因治疗中图分类号R394.21文献标识码AStudyofCancerVaccinewithIrradiatedB7-1TransgenicCellsLIUYan,WANGXiao-min.XUWan-hai»etal.DepartmentofUrology«TheFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity.HarbinHeilongjiang.ChinaAbst

3、ractObjectiveToinvestigatethesynergisticallyeffectofirradiatedB7Ttransfcclantcellsascancervaccine.MethodsTheeukaryoticexpressionvectorencodingB7-1genewastransfectedintoCAK-1renalcellcarcinomacells.Thecellswereusedtotreatthemiceandthethera|>euticeffectswereassessed.ResultsIncontrasttothemiceinCAK1

4、/WtorC'AK-l/pCDNA3groups*thetumorigenicityofCAK-l/B-7transfectantdecreased(P<0.()()1).Immunizationofmicewith“CoirradiateCAK-1/B7-1tumorcellsshowedsignificantsystematicprotectiveeffectsagainstthesequencerc-challengeofCAK-1/Wt.Vaccinationwith">CoirradiatedCAK1/B-7cellsdelayedtheoccurren

5、ceoftumorandprolongedthesurvivalperiodofmicewithtumor.ThevaccineofCAK-I/B71inducedanenhancedtherapeuticeffect(PVO.()1).ConclusionIrradiatedtransgeniccellscouldenhancetheantitumorimmunityofthehost.VaccinesofCAK1/B7-1canimproveimmunityofhostandarepromisingcancervaccines.【Keywordsj137-1；Cancervaccine；G

6、enetherapy目前对肾肿瘤的免疫治疗有使用里组白细胞介素-2或白细胞介素2与干扰素-a同时使用，以及输入经体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞或日体瘤细胞疫苗的方法，但疗效都不甚理想，其主要原因在于肿瘤抗原进入体内后不能被有效地提呈。肿瘤疫苗与传统疫苗在概念上不同，它主要不是用于肿瘤的预防，而是通过瘤苗的接种刺激机体对肿瘤的免疫应答来治疗肿瘤。由于人肿瘤相关抗原的免疫原性很弱，不足以有效地刺激机体的免疫应答，因此单纯用自身或同种肿瘤细胞作瘤苗治疗肿瘤的效果不好。B7因子主要存在于活化的B细胞和抗原递呈细胞表面。在通常性况下，肿瘤细胞合成的胞内抗原经胞内降解、处理后,形成的肿瘤肽抗原与MHC1类分子

7、结合后，共表达于痛细胞表面。其表面的肽抗原-MHCI类分子复合物被TC细胞识别，同时其表面B7因子也与TC细胞的CD28分子结合，这样TC细胞就可被活化，从而杀伤带有该肽抗原的肿瘤细胞。大多数肿瘤细胞由于没有B7因子，因此肿瘤细胞虽具有肽抗原与MHCI类分子的匆合物，但由于不能提供第二信号，所以不能活化TC细胞本研究旨在利用B7基因转染肾肿瘤细胞.使之表达膜B7因子，形成瘤苗，接种到体内后直接活化TC细胞，诱导其杀伤肾脏肿瘤，从而为肾脏肿瘤的临床治疗提供新的方法和思路。1材料与方法1.1主要试剂Lipofectamine200()转染试剂购自Invitrogen公司；RPM11640、DMEM

8、培养液、胎牛血清和G418均收精日期：2008-11-21基金项目：黑龙江省卫生厅科学技术项目(2006-234)作者单位：哈尔滨医科大学第四临床医学院泌尿外科(哈尔滨购自Gibco公司。含人B7-1cDNA完整开放阅读框架的真核表达载体PCDNA3-B7-1由研究室自行构建。1.2细胞株和实验动物CAK-1肾癌细胞系从美国ATCC获得，本室常规培养。C57BL/6小鼠购自中国医学科学院.雌性,68周龄。1.3 方法1.3.1CAK-1细胞转染与克隆取对数生长期的CAK-1肾癌细胞接种于6孔板，每孔5xW5个，待细胞融合率达到9()%时，分别加入用转染试剂Li-pofenctamine20(X

9、)包被的pCDNA3-B-7重组载体和PCDNA3空载体，培养48h后.加G418(600Mg/ml)继续筛选培养，12天后.分别挑去抗药克隆，用RT-PCR和Westernblot检测B7-1表达的表达情况.得到转B7-1基因和阴性对照的CAK-1肾癌细胞系。1.3.2细胞的放射处理上述转基因细胞依实验要求用6孔培养板培养.实验前8h用Co进行亚致死量照射(5000Rad),经检测，此时细胞的存活率>95%,具有正常表达及分泌能力。1.3.3 小鼠成瘤试验分别取非照射的1x107CAK-l/WuCAK-l/pCDNA3XAK-l/B7-1细胞接种C57BL/6小鼠背部皮下，每隔2天观察

10、并记录结节形成时间、生长速度及存活时间。每组5只，结节大小以长径X短径计算。1.3.4转基因细胞的免疫保护试验小鼠随机分组分别注射经SC。照射的CAK1/Wt、CAK-1/pCD-NA3.CAK-1/B7-1细胞5X1()1()天后皮下接种非照射的CAK-1/Wt细胞,观察肿瘤结节的生长情况及小鼠的存活时间。1.3.5转基因细胞的试验性治疗以非照射的CAK-1/Wt细胞1X10$皮下接种C57BL/6小鼠，接种后第3、6、9天以的Co照射的2.5x伸CAK-1/Wt细胞分别和2.5X10'各种转基因细胞1：1混合，再接种对侧皮下,观察肿瘤结节的生长情况及小鼠的存活期。1.3.6统计分析

11、实验数据以均数土标准差(x±5)表示，采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理.组间比较采用t检验,PV0.05为具有显著性差异。2结果2.1转基因细胞株的建立对转染后的CAK-1细胞进行RT-PCR和Westernblot分析显示，与pCDNA3空载体转染对照细胞相比，pCDNA3-B7载体转染的CAK-1细胞中B7基因无论是mRNA水平还是蛋白水平均有明显升高(图1：A.RT-PCR检测B7基因转录本的水平；B.Westernblot检测B7蛋白的表达情况)。ABpCDNA3pCDNA-B-7pCDNA3pCDNA-B-7图1PCDNA3-B7载体转染CAK-1细胞后B7基因

12、的袤达检测Figure1ExpressionpatternofB-7geneaftertransfectingpCDNA3B-7vectorintoCAK-1cells2.2转基因细胞的肿瘤原性用1x侦个非照射的转基因细胞CAK-1/B7-1与CAK-1/Wt、CAK-1/pCDNA3肿瘤细胞接种小鼠皮F，CAK-1/B7-1与CAK-1/Wt.CAK-1/pCDNA3细胞在小鼠体内的生长状况及存活期明显不同肿瘤结节的检出时间、生长速度及存活期差异无显著性。而CAK-1/B7-1细胞组肿瘤的形成时间明显推迟，生长速度明显减慢，存活期也显著延长，见表1。>1CAK-1/B7-1转基因痛苗的

13、致瘤效应明显减弱(x±5)Table1ReducedtumorigenesiscapacityofCAK-1/B71transfcctants(t±s)细胞出瘤鼠/总鼠数(只)成痛率成瘤时间平均存活平均瘤2周3周4周6周()(d)时间(d)体积(cn?CAK-1/Wt(：AK-l/pCDNA3CAK-1ZB7-13/53/55/5-10018.6±4.232.4±5.28.4±2.72/53/55/5-KX)19.3±5.730.0±2.39.1±1.«0/52/52/53/5.40*28.5±

14、1.8"42.0土().0.3.5±U.6,注:CAK-1/B71与其它两组比校，PV0.012.3转基因细胞的免疫保护作用的CAK-1/Wt和CAK-l/pCDNA3细胞未能诱导有用5XIO。个®Co照射处理的CAK1/B7-1与效的保护性免疫。在14天左右可检出肿瘤结节，存活CAK-1/Wt、CAK-l/pCDNA3肿瘤细胞作为瘤苗分别期约45天。而经CAK1/B7-1细胞免疫后的小鼠肿免疫C57BL/6小鼠，10天后接种非照射的CAK-1/瘤生长明显抑制，观察期结束时仍有3只小鼠未检出Wt肿瘤细胞,观察免疫保护作用。结果表明&>Co灭活结节，生

15、存时间显著延长(,PV0.(X)1,见表2)。结果提示转基因细胞的免疫原性显著增强，并能诱导机体产生有效的抗肿瘤效应。表2CAK-1/B7-1转基因痼苗对野生型CAK-1细胞可诱导免疫保护效应Table2AntitumorimmunityprotectioninducedbyCAK1/B7-1againstthechallengewithwildtypeofCAK-1细胞出瘤鼠/总鼠数(只)2周3周4周6周CAK-1/Wt2/54/55/5-CAK-1/pCDNA32/54/55/5-CAK-1/B711/51/5-2/5*2/5,注:CAK-1/H7-1组与其它两组比较，PV0.0012.4

16、转基因细胞的试验性免疫治疗用非照射的CAK-1/Wt肿瘤细胞IX1(),预先接种C57BL/6小鼠，在3、6、9天用"Co照射的2.5xW5CAK-1/Wt细胞分别和2.5xIO'各种转基因细胞1：1混合，接种于对侧皮下,观察肿瘤生长情况。在治疗实验中，接种了CAK-1/B7-1转基因细胞的小鼠肿瘤生长较对照组明显减慢，此治疗可明显推迟肿瘤结节检出时间，延缓肿瘤的生长速度，并有效地延长了荷瘤宿主的存活时间(,PV0.01),见表3。表3射线照射的转基因痼苗对野生型CAK-1细胞致痛的治疗作用G±5)Table3TherapeuticeffectonCAK-1/Wtt

17、umorwithirradiatedtransfectantstreatment(x±s)细胞出痛鼠，总吸数(只)成痛时间平均存活平均痛休2周3周4周6周(d)时间(d)积(cm5)CAK-1/pCDNA3CAK-1/B7-12/53/50/51/55/5-3/53/514.315.731.0+3.525.311.6-45.0±0.0*11.2±2.63.6±1.4-注:组间比较，PV().()13讨论大量的研究表明，将某些细胞因子基因转入肿瘤细胞制成新型的肿瘤疫苗，可以有效的激发机体有效的抗肿瘤免疫功能，此种方法已成为肿瘤基因治疗的研究热点。本研究应用

18、B7-1转基因修饰的CAK-1肿瘤细胞既能表达活化因子B7,同时又具有所有的肿瘤细胞抗原,可激发抗肿瘤免疫。虽然其体内的成瘤性降低，但是直接用此种细胞进行治疗的危险性仍然较大(表1)。作者将细胞经"Co照射后，进行了免疫保护试验和治疗性实验，观察到明显的抑瘤效果。众多实验表明，细胞因子基因在肿瘤局部的持续表达可以有效地改变肿瘤细胞的免疫微环境,增强肿痛细胞特异性的抗原提呈，活化CTL细胞，从而产生抗肿瘤免疫。本次实验结果表明经B7基因修饰后的CAK-1细胞致瘤原性有很大程度的降低.肿瘤生长潜伏期及荷瘤生存期明显延长。在基因转导细胞作为痛苗用于小鼠免疫接种的实验中，结果发现明显的抑瘤效

19、果，荷瘤小鼠无论是成瘤时间，还是存活时间，都比对照组有显著的延长，肿瘤体积也明显减小,说明经过射线照射和基因修饰的肿瘤疫苗能够有效并且相对安全的诱导抗肿瘤免疫。当然，作者在实验过程中也发现B7转基因细胞不能完全消除肿瘤细胞的致瘤性，说明依赖于单一活化因子具有一定的局限性，并不能提供完全的抗原递呈及活化效应，联合不同的细胞因子，产生协同作用有可能很好的解决这个问题。如IL-2和IL-6等细胞因子,它们均可激活T细胞，诱导NK、LAK、CTL细胞活性，此外JL-2nf以改变T细胞的异常信号传导，而IL-6可以增强细胞MHC抗原的表达旭刃。因此由这些细胞因子基因修饰的肿瘤细胞可以从多种机制获得更好的抗原递呈及免疫刺激效果。显然在肿瘤疫苗应用中，如何更好地促进肿瘤抗原的递呈,加强生物安全性，仍是肿瘤生物治疗研究中一个难题。参考文献1 BrunoS.TcncaC,SaverinoI),etal.Apopiosisofsquamouscellsatdifferentstagesofcarcinogenesisfollowing4HPRtrcatmcntJ.Carcinogenesis,2(X)2,23(3)：447-456HanahanD,WeinbergRA.Thehallmarksofc