猪细小病毒病毒样颗粒疫苗研究进展.docx

1、河南农业科学,2015,44(10)：12-16JournalofHenanAgriculturalSciences猪细小病毒病毒样颗粒疫苗研究进展刘运超I,陈玉梅堆，姬鹏超I,赵宝磊3,王聚财3,邓瑞广I,张改平(1.河南省农业科学院河南省动物免疫学虞点实脸室/农业部动物免疫学重点实验室，河南郑州450002；2.郑州大学基础医学院，河南郑州4500()1；3.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002)摘要：猪细小病毒(PPV)感染可导致母猪繁殖障碍、断奶仔猪多系统衰弱综合征和肠炎性腹泻等疾病，给养猪业造成巨大的经济损失。临床防控以接种疫苗为主，常用的疫苗有弱毒疫苗和灭活疫苗。随着生物

2、技术的发展，新型PPV疫苗的研完工作成绩显著。VP2蛋白是PPV主要的衣壳蛋白，对研究新型PPV疫苗至关重要，综述了猪细小病毒VP2蛋白及病毒样颗粒疫苗的研究进展，以期为新型PPV疫苗的研究提供参考。关键词：猪；猪细小病毒；VLP；疫苗；VP2蛋白中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1004-3268(2015)10-0012-05ResearchProgressofVirusLikeParticlesVaccineAgainstPPVLIUYunchao',CHENYumei1,2,JIPengchao',ZHAOBaoIei3,WANGJucai3,DENGR

3、uiguang1,ZHANGGaiping1,3-(1.HenanProvincialKeylaboratoryofAnimalImmunology,HenanAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture,Zhengzhou450002.China；2.CollegeofBasicMedicalScience,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China;3.CollegeofAnimalScienceandVeterinary

4、Medicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002tChina)Abstract:Porcineparvovirus(PPV)isthemajorcausativeagentinswine,whichusuallycausesreproductivefailure,weanedpigletsmultiplesystemweaksyndrome,inflammatorydiarrheaandotherdiseasescausingseriouseconomiclossesintheswineindustry.Thevaccinationist

5、hemosteffectivemethodforpreventingPPVinfectionanditscomplications,whichincludingattenuatedvaccineandinactivatedvaccine.Withthedevelopmentofgeneticengineering,theresearchworkofthenovelvaccineagainstPPVhasaremarkableprogress.TheVP2proteinisamaintargetforneutralizingantibodies,whichisveryimportantforth

6、enovelvaccineagainstPPV.ThispaperreviewedtheresearchprogressofparvovirusVP2proteinandviruslikeparticlesvaccineagainstPPV,whichwouldbehelpfulforthenovelvaccineagainstPPV.Keywords；swine；porcineparvovirus；VLP；vaccine；VP2猪传染病对我国养猪业危害严童，防治猪传染病对养猪业发展至关重要。猪细小病毒(porcineparvovirus,PPV)是一种极为常见的病原体，常引起猪的繁殖障碍，怀

7、孕母猪的死胎和“木乃伊胎”、断奶仔猪多系统衰弱综合征等。PPV属于细小病毒科细小病毒属，无囊膜病毒，平均直径20-26nm,分子质量为5.3Xi。、ku,是目前动物病毒中最小的一类单链线状DNA病毒。PPV流行极为广泛，95%的猪场检测为病毒阳性，给养猪业造成巨大的经济损失"。PPV可在病猪心脏、肺脏、脾脏和性腺中复制，但其主要靶器官是母猪子宫，子宫内病毒含量最高可达10”拷贝/mL°PPV在母猪和仔猪体内的致收稿日期：2015-05-21基金项目：中国博上后科学基金(2013M541980)；河南省柬大科技专项(141100110100)；河南省基础前瞻类项目(20141

8、644)作者简介：刘运超(1982-),辨，河南周口人，助理研究员，博士，主要从事动物疫病与疫苗研究。E-mail:yunchaoliu2012*通讯作者：张改平(I960-),男，河南内黄人，研究员.博士，主要从事动物疫病免疫机制亍疫苗研究。E-mail:zhanggaiping2OO3病位置略有差异，主要感染母猪的繁殖器官.同时也破坏肺脏等呼吸器官和脾脏等免疫器官；而对仔猪的损伤主要是破坏脾脏和性腺等生理功能，同时破坏心脏等中枢器官，从而造成死亡刁。Bachmann等'研究表明,PPV感染妊娠55(I以下的母猪可引起死胎41是感染妊娠72<1以后的母猪却不影响胎儿正常分娩与存

9、活。1猪细小病毒基因组结构特点1967年Cartwright在流产母猪体内首次分肉到PPV,该病毒届于细小病毒科，成熟的PPV病毒慕因组大小约5kb.3,-端仃折登形成Y形结构的102bp的回文序列.5'-端有一个折格形成U形结构的127bp的Ml文序列43o研究"显示，PPV基因组包括2个开放阅读框(openreadingfragment,ORF),ORF1编码非结构蛋白NS-LNS-2和NS-3；ORF2主要编码结构蛋白VP1、VP2和VP3；另外PPV基因组还包含一个小的ORF,编码非结构卜白SAT-。PPV的NS序列在进化上相对保守.其编码的非结构蛋白在调控PPVDN

10、A复制方面发挥作用。PPV结构蛋白经过规则的排列组装形成病毒衣壳蛋门，能够包爆病存DNA入侵宿主细胞。Molitor等9采用SDS-PAGE方法整定rPPV的3个结构蚩白VP1、"和VP3,且证实这3种蛋门质均能诱导兔,产生抑制红细胞凝集抗体，VPI蛋白C-端敏基酸与VP2N-端基域酸序列用!£而：占，该区域仃含碱性基基酸残堪.能增强PPV与宿主DNA的结合,稳定病毒的单链基因组【)NA,在病毒侵染细胞过程中起爪要作用0”。VP3nr能是VP2翻译后加匚的产物.只出现在衣壳装配和病毒基因组包装后m。VP2蛋n是构成病毒衣壳的主要:成分.约占病毒衣壳蛋白总量的80%,包含PP

11、V主要的B细胞和T细胞抗原丧位°目前，发现'P2上有9个线性B细胞表位，在其N末端区域发现石病毒中和表位,，J，'5oSedlik等16研究发位，VP2蛋白C末端的完整性对于病毒衣壳的形成是必不可少的。重组表达的PPVVP2蛋白能自我装配成病莓样颗粒(virus-likeparitcles,VLP)(图I).是应好的免疫原，能够刺激机体产生高滴度抗PPV抗体，保护机体免遭病毒的攻击，7o同时.PPVVLP能够在VLP表面展示其他病毒来源的抗面展向，也是良好的抗原转运载体”。因此.研究VP2蛋白和VLP的形成对发展PPV新型疫苗具有很高的价值图1PPVVP2及其形成的V

12、LP的结构2猪细小病毒传统疫苗PPV的传统疫苗主要以弱毒苗和灭活|Y|为主。些早用于临床的PPV疫苗是NADL-2弱毒株疫苗,Paul等"将PPV强毒株经过50次的细胞连续传代.获得可用作疫苗的PPV弱毒株。但进一步的研究结果显示，在对母猪经口邸接种PPV致弱苗后，致弱的PPV不能经胎盘感染胎儿，但当在子宫内接种PPV致弱苗后，致弱苗可以感染胎儿其至导致胎儿死亡，因此,PPV弱毒苗应限于非怀孕母猪使用，安全性有待提高。国内研究者对PPV弱毒疫苗也进行了一些研究。广西兽医研究所蒋正雯等201分离到1株自然弱毒株(PPV-N株)，并于2006年用PPV-N株弱卷疫苗进行区域试验，结果显示

13、,PPV-N株弱荏疫苗能有效抵抗PPV强能攻击，在猪场应用取得了明显的经济和社会效益由于PPV弱毒疫苗有毒力返强的危险，各国研究者开始采用更为安全的灭活疫苗。20世电80年代,PPV灭活苗在美国、澳大利亚以及法国等国家得到r普遍的应用。在中国，从国产再用生物制品的批签发数据来看，目前使用的PPV疫苗主要是灭活疫苗，包括WH-1株、CP-99株和BJ-2株3种毒株。PPV疫苗的应用大大降低了因PPV感染引起的母猪繁育失败，目前仍是预防猪细小病毒感染的主要手段。PPV疫苗经历了弱毒苗到灭活苗的发展过程，安全性有了很大提高。但是，灭活疫苗存在灭活不彻底和散毒的可能，而弱毒疫苗存在毒力返强及重组的危险

14、，故研制一种安全、高效的新型PPV疫苗迫在眉睫。猪细小病毒结构蛋白VP2由于其良好的免疫原性及其可自行装配成病毒样颗粒(VLP)的特性，给PPV的免疫预防带来了广阔的应用前景。3猪细小病毒VLP疫苗的研究3.1PPVVP2形成的VLP疫苗Marlinez等(将PPVVP2基因成功克隆到杆状病毒表达系统中，利用VP2蛋白自我组装的特性，成功地制备了PPV类病毒粒子(VLP),试验结果显示，其免疫效果与商品化的PPV疫苗相当。Antonis等;”'应用杆状病毒表达载体系统成功制备出PPV类病毒粒子，并对豚鼠、仔猪和怀孕母猪进行r免疫试验。该研究小组利用杆状病毒表达的PPVVP2蛋白能自行装

15、配成VLP,电镜下呈球形颗粒，直径2()3()nm,形状大小与PPV病毒粒子相似网。该研究以多种佐剂混合PPVVLP后免疫豚鼠，每只免疫0.2|ig,在免疫后28d和49d分别采用血凝抑制试验(hemagglutinationinhibitionassays,HI)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)和病毒中和试验检测豚鼠抗体变化。检测结果显示，VLP免疫的豚鼠产生较高的特异性抗体和中和抗体.未免疫组没有产生抗体，且PPVVLP免疫组豚鼠,产生的中和抗体显若高于商品化灭活疫苗免疫组。研究者在怀孕的母猪中进行了类似的试验.未免疫的阴性母

16、猪没右.抗休反应。在免疫的各组中,PPVVLP免疫后28dPPV抗体的HI效价在10'在免疫后49dHI效价可以达到10"。灭活疫苗免疫组产生的PPV特异性抗体滴度和H1滴度与VLP免疫组相当，但是中和抗体效价显著低于VLP免疫蛆。这一结果与豚鼠试验结果-致，表明VLP疫苗在刺激机体产生中和抗体方面比PPV灭活疫苗更有优势。进一步的攻毒保护试我验证了这种VLP疫苗的免疫保护效力。试验分为VLP免疫组和未免疫组0PPVVLP免疫组16头母猪，每头免疫剂虽0.7牌.免疫28d后HI平均效价达到10"以上.免疫后77dHI均效价达到10以上，未免疫组10头母猪未检测到II

17、I效价。免疫后77d进行PPV攻毒试验，观察2组母猪产仔的情况。免疫组有10头母猪产仔，平均每头产仔质为518头，对照组有7头母猪生产69头仔猪。在未免疫组生产的69头仔猪中，HA检测为PPV病毒阳性的仔猪有54头，占总数的78%；ELSIA检测为PPV阳性的仔猪有69头，占总数的91%。但是，采用同样的检测方法.免疫组母猪生产的仔猪中均未检出PPV病毒。这表明PPVVLP疫麻具有很好的免疫保护效力，能够保护怀孕母猪和仔猪免受PPV病毒侵袭。随后，乂有多位研究者将PPVVP2基因克隆到杆状病毒表达系统中进行蛋白质表达，成功获得了PPV类病毒粒子，且能在豚鼠和猪体内诱导高滴度的抗体产生l24&#

18、39;25Jo另有研究者在酵母表达系统中将PPVVP2蛋白进行成功表达，并在体外装配形成VLP,且具有良好免疫效果，诱导动物体产生高滴度的抗体26271o以上研究表明，真核表达系统表达的PPVVP2能够形成PPVVLP,并且能够在豚鼠和猪体内诱发B细胞免疫反应，产生高滴度的针对PPV的抗体。杆状病毒表达的PPVVLP疫苗的免疫效果在试验中得到肯定，但是受制于杆状病毒表达系统的高昂成本，这种疫苗的推广具有很大的难度。原核表达系统产量高、成本低、技术难度较低，具有明显的成本优势。司艳红等】利用PCR方法将扩增的PPVVP2完整基因克隆到原核表达载体pET-32a中,在大肠杆萌中成功表达了VP2与T

19、rx-His-tag的融合蛋白.但是重组蛋白以包涵体形式表达.经过复性处理后未能得到VLP。试骑结果显示，PPVVP2包涵体虽然能够引起针对PPV的免疫反应，但是没有证据显示这种免疫反应具有足够的保护力，而PPV-VLP疫苗能够诱发足够的免疫保护抵抗PPV的感染。不同表达系统表达的VP2蛋白在组装VLP和免疫活性上的差异与VP2蛋白的结构有更要关系。上述研究结果显示，杆状病毒表达的PPVVP2蛋白能够组装成VLP并诱发足够的免疫反应，但是大肠杆菌表达的VP2蛋白不能蛆装VLP,免疫效果不佳。这表明PPVVLP的形成与免疫保护效果密切相关，进而受到蛋白质来源的影响。另外，Qi等“应用pET-32

20、a载体系统利用大肠杆ftRosetta菌株成功表达了可溶性的PPVVP2重组蛋白，提示原核表达的VP2蛋白也有形成VLP的可能性。PPVVLP疫苗与传统灭活疫苗相比有几个显著的优点：其构象表位更类似于病毒，易产生类似于病毒的抗体反应或免疫系统反应；由于VLP疫苗不包含病毒基因组.不含布潜在的病毒致病基因，因此能诱导抗体应答而无感染危险性，安全性较高;lh于VLP制备的产率比猪细小病毒组织培养要高得多，其生产成本明显较低，这可以提供一种更为经济右效的疫苗。3.2基于PPVVP2形成的VLP嵌合疫苗Sedlik等研究发现，在PPVVP2N端引入脊懈灰质炎病毒的T、B细胞表位并不影响VLP结构的形成

21、，旦引入的T细胞表位能够在体内诱导T细胞免疫应答，同时引入的B细胞表位多肽并没有引起相应特异性抗体产生。随后，该课题蛆乂将淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocyticchoriomeningitisvirus,LCMV)的CD8*T细胞表位引入PPVVP2N端制备成嵌合VLP疫苗，免疫注射或鼻内给药途径免疫猪，结果显示，嵌合VLP疫苗能够引起机体产生高滴度的抗PPV的抗体，同时界内免疫也引起了强烈的肽特异性细胞毒性T细胞(cylotoxicTcelLCTL)的免疫应答f29)oMoron等【抻：将鸡卵清白蛋白(chickeneggovalbumin,OVA)的257264表位多肽插入侧翼

22、序列(LEQLESIINFEKLTE)，并引入到PPVVP2N末端，用杆状病毒表达系统表达并制备成嵌合VLP疫苗PPV-VLP-OVA,结果表明PPV-VLP-OVA可以经由树突状细胞呈递给CD8'T细胞，引起相应的免疫应答。随后Rueda等研究了引入仅仅插入OVA表位肽及引入不同侧翼序列的外源OVA表位肽制备成不同类型的嵌合疫苗，结果显示，侧翼序列的正确插入有助于MHCI对PPV-VLP-OVA的递呈。Rodriguez等”将疟原虫虫株环子弛子蛋白(circumsporozoiteprotein,CSP)的CD84Tcell表位多肽(SYVPSAEQI)引入PPVVP2N末端，用杆状

23、病毒表达系统表达.制备成嵌合疫苗PPV-PYCSVLP并免疫动物，结果表明，嵌合PPV-PYCSVLP可以明显增强CD8，T细胞的免疫应答。有研究者将合成的4拷贝的生长抑素(Somatostatin)多肽(SS4)引入PPVVP2N末端用杆状病毒表达系统表达，制备成嵌合疫苗PPV-VLPs-SS4并免疫动物，结果表明该疫苗效果同灭活苗一样，均能够引起机体产生高滴度抗PPVVP2的抗体，同时也能产生特异性中和抗体，另外，该嵌合苗也刺激机体产生了抗SS抗体叫。上述研究结果显示，PPVVP2蛋白、端引入部分敏基酸并不影响其VLP的形成，也不影响该嵌合VLP引起机体PPV抗体的产生；且经引入T细胞表位

24、多肽序列，可引起相应的T细胞免疫应答反应，增强VLP疫苗的T细胞免疫应答效果。这些研究成果为PPV疫苗的研制提供了新思路，为PPVVLP疫苗及多价疫苗的研制提供了理论基础。4展望PPV在我国猪场广泛流行，造成养猪业巨大的经济损失。PPV的防控主要依靠接种PPV疫苗，因此，疫苗的质量与效果对PPV的防控有着重要的影响。PPV疫苗经历了弱毒疫苗到灭活疫苗的发展过程，但是由于病毒灭活不彻底、弱毒株毒力返强和病常基因重组等危险的存在，传统PPV疫苗在应用中暴露出越来越严重的问题。因此，研制一种安全、高效的新型PPV疫苗对PPV的防治至关重要。PPVVLP疫苗具有高效的免疫原性，而且不存在散毒和基因重组

25、的威胁，给PPV的免疫防控带来了新的希望，成为各国研究的焦点。随着对PPV新型疫苗研究的深入.PPVVLP疫苗必将在PPV防治中发挥重要作用。参考文献：I蔡群德.刘建设.猪细小病毒的流行特点及防控J.畜牧兽医杂志.2012,3(6)：】02.2OraveerakulK,ChoiCS,MolitorTW.TissuetropismsofporcineparvovirusinswineJ,.ArchivesofVirology,1993,130(3/4)：377-389.3BachmannPA,ShefTyBE,VauhanJT.Experimentalinuteroinfectionoffeta

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