高分子在葡萄糖检测中的应用

1、 高分子在葡萄糖检测中的应用 摘要 本文的主要目的在于：一是阐述几种葡萄糖的检测原理；二是在材料领域列举一些最近研究过的用作葡萄糖检测的高分子，并简单介绍其在检测过程中的发挥的作用。总的来说，本文是一篇以前人实验结果为基础的综述性概括。关键词 高分子，葡萄糖检测引言 葡萄糖作为一项人体的生化指标，其检测一直备受关注。长期以来，在研究人员不断的努力下，产生各式各样的检测原理。在已有检测原理的基础之上，人们又不断寻求反应时间更快，检测时间更短，灵敏度更高的方法。但优异的功能需要有良好的物质材料作为依托，高分子这个领域就为其发展提供了广阔的空间。千变万化的高分子材料为我们提供了许许多多的选择，我们总

2、能在其中找出一种或几种满足需求的。近年来，已有不少的研究工作在这一方面取得了进展，为高分子应用于葡萄糖检测奠定了理论基础。 1、 常见葡萄糖检测原理 1.1菲林试剂还原法说到葡萄糖检测方法，真可谓层出不穷。菲林试剂还原法是大家都比较熟悉的用于检测尿糖的方法。菲林试剂由甲乙两种溶液混合而成，甲液是硫酸铜，乙液是氢氧化钠和酒石酸钾钠的混合液。两者混合后生成的氢氧化铜沉淀在酒石酸钾钠存在的情况下与葡萄糖作用，在加热的条件下能生成砖红色氧化亚铜沉淀，由此鉴定葡萄糖的有无。当然，这种检测方法针对的是还原性糖，即凡是具有还原性的糖都能与菲林试剂发生显色反应，因此该方法对葡萄糖的检测没有特异性。 1.2荧光

3、法1葡萄糖能使荧光染料(3-5-(4-二甲氨基苯基)-4,5-二氢哑唑-2-苯磺酰胺基苯硼酸)的荧光发生淬灭。在磷酸缓冲液pH=9.0，ex=362nm，em=573nm条件下测定，最低检测限为5*10-6molL-1。此法用于测定血清中的葡萄糖。 1.3酶法1酶比色法葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生过氧化氢，过氧化氢在辣根过氧化物酶的催化作用下使荧光素产生褪色，荧光素在490nm处有很强的吸收，以空白Ao值减去各标准溶液的A值，作葡萄糖浓度A工作曲线，计算葡萄糖含量。1.3.2酶荧光法以硫胺素为荧光底物的葡萄糖荧光分析方法，固定化酶柱催化氧化葡萄糖而生成过氧化氢，生成的过氧化氢又被辣根过氧化

4、物酶催化氧化硫胺素生成硫胺荧，硫胺荧的激发波长在375nm，发射波长在440nm，荧光强度与葡萄糖浓度成正比。此方法用于测定血清中的葡萄糖，检测限为0.15mgL-1。1.3.3酶电极法葡萄糖氧化酶在有氧条件下催化-D-葡萄糖（葡萄糖水溶液状态）氧化，生成D-葡萄糖酸-内酯和过氧化氢。过氧化氢与过氧化氢型电极接触产生电流。该电流值与-D-葡萄糖的浓度呈线性比例，在酶电极葡萄糖分析仪上直接显示葡萄糖含量，最低检出限量为1.0mg/100ml。基于电极法的葡萄糖传感器研究较多，酶的固定化方法很多，如吸附法、载体偶联法、交联法和包埋法等。除了上述所列举的几种检测方法外，还有光散射法、近红外光谱法、脉

5、冲电伏安法等等。总之，现在不缺乏葡萄糖的检测方法，我们需要做的是如何优化检测手段，使之能够快速而又准确的测定葡萄糖含量。2、 高分子在葡萄糖检测中的应用 2.1以苯硼酸为基础的葡萄糖检测高分子 近几年来，由于苯硼酸在针对糖尿病治疗的胰岛素自调控释放结构的潜在应用，以苯硼酸为基础的葡萄糖响应高分子材料已经引起了极大注意。 Siddiq等人2制备出了一种带有4VP并以苯硼酸为基础的微凝胶，能够在生理pH和正常体温下与葡萄糖发生作用。4VP与苯硼酸的结合能够显著地降低本硼酸的pKa,依靠的是路易斯酸碱的相互作用；此外还能够提高体积相转 图（1）变温度。因此这种复合结构能在生理pH和正常体温条件下提高

6、葡萄糖检测的灵敏度。为了进一步降低葡萄糖检测时的pH值，Sumerlin3和他的同事报道了一种包含苯硼酸的嵌段共聚物，其pKa为8.2。该嵌段共聚物由N,N-二甲基乙酰胺和带有丙烯酰胺的硼酸单体经RAFT聚合而成。在pH低于8.2时，嵌段共聚物能自组装成聚集态。通过加碱使其pH>pKa或者在pH为7.4的条件下加入葡萄糖都会致使聚集态分解。这种特性有希望在生理条件下实现药物的控制释放。 图（2）除了微凝胶和自组装在葡萄糖检测上有应用外，最近也有基于苯硼酸的自组装囊泡被报道出作为载体来检测传感葡萄糖。Van Hest等人4设计了一种利用糖分子响应的嵌段共聚物来诱发控制渗透的聚合物囊泡纳米反

7、应器。他们发明了一种很简单的方法来使聚合物囊泡产生膜渗透的能力，该聚合物囊泡中含有常见的两亲性嵌段共聚物，PEG-b-PS。他们这种设计方法的关键步骤在于使用刺激响应的嵌段共聚物作为小孔生成的成分。他们合成了一系列的糖响应的嵌段共聚物，如PEG-b-PSBA，2b-4b等。合成手段采用ATRP，用特己酮作为保护剂的乙烯基本硼酸，通过PEG大分子引发剂起始反应，之后移除特己酮即可。 图（3） PEG-b-PSBA自组装成囊泡之后可以在升高pH和加入糖分子的情况下分解成可溶性的嵌段共聚物。当同时使用嵌段共聚物PEG-b-PSBA和PEG-b-PS时，聚合物囊泡便获得了可控渗透的性质。这归功于PS和

8、PSBA不混溶，使得在相分离的囊泡膜上能有刺激响应PSBA的区域。这种聚合物囊泡已成功作为封装酶的纳米反应器，其中的PSBA区域成为小分子物质跨膜转运的小孔通道。 2.2过氧化聚吡咯在葡萄糖传感中的应用5聚吡咯，一种常见的导电聚合物，已被广泛应用于电化学传感器和生物传感器。在传感检测中杂离子的干扰是不可避免的，但利用过氧化聚吡咯能够一定程度上解决这个问题，这也是该高分子化合物被广泛使用的原因。于浩等人通过两步电化学过程制备了一种经钴氧化纳米簇和过氧化聚吡咯复合物修饰的电极。制备出的电极用电化学方法和SEM进行检测，结果表明修饰后的电极有良好的稳定性、抗干扰性以及在葡萄糖氧化过程中有很好的电催化

9、效率。图（4）是制备出的电极检测后得到的循环伏安曲线。从实验图可以看出，葡萄糖加入之后一个处于0.53v的阳极峰能被观察到。在CoOx/OPyox/CCE上葡萄糖响应的电流值比在CoOx/CCE要高得多。这一点证明出过氧化聚吡咯高分子能改善CoOx的电催化性能。CoO2/CoOOH基团催化氧化葡萄糖 的机制可能是： CoOOH + OH CoO2 + H2O + e ； 图（4）CoO2+ H2O +glucose CoOOH + OH +gluconolactone 在人的血样中，维生素C（AA），多巴胺（DA），尿酸（UA）和葡萄糖是共存的，但在正常生理状态下葡萄糖含量是前三者的30多倍。

10、图（5）是在100uM葡萄糖浓度下测定AA，UA和DA对葡萄糖检测影响的实验结果。结果显示，10uM的AA,DA和UA分别给出了3.9,2.3,3.1的相对误差（曲线a所示）；而5uM的AA,DA和UA给出了14.1，8.7和10.2的相对误差。此外，该小组同样就麦芽糖和果糖对葡萄糖检测的影响做了实验测量，结果显示向100uM葡萄糖中加入50uM麦芽糖和100uM果糖之后，不会对葡萄糖的测量产生任何 图（5） 影响。以上所有结果表明，修饰后的电极有优异的抗干扰能力。这种优异的抗干扰能力可能来源于过氧化聚吡咯。在过氧化的过程中，掺杂的离子从聚吡咯分子表面脱离出来，一些含氧的基团比如羰基和羧基被引

11、入作为聚吡咯的组成单元，导致高分子带上负电荷。在静电排斥力的作用下，过氧化聚吡咯能够排斥一些带负电的分子，防止与之结合，实现一定的抗干扰能力。总的来说，该小组的工作设计制备出了一种新型结构的电极。该电极不仅在稳定性和稳定性有所提高，同时还具有一定的抗干扰能力以及比较高的催化葡萄糖氧化能力等。基于上述优势，该电极可以被用于检测人体血样中的葡萄糖含量。2.3光子晶体水凝胶可选择性传感葡萄糖6最近，在水和空气的交界面上快速制造2-D CCA（胶体晶体微阵列）已经成功实现。这种自组装方式能够在2分钟内生成连续性的2-CCA单层。同传统的3-D CCA自组装相比，这种气液界面的反应方式更加简单快速。由于

12、2-D CCA很容易合并进入水凝胶，所以将2-D CCA与葡萄糖响应的水凝胶相结合，用来提高制造速度和检测灵敏度。薛飞等人根据上述理论开发出基于2-D CCA的可视化葡萄糖传感。他们将2-D CCA单层和用苯硼酸修饰过的水凝胶结合，当这种复合结构与葡萄糖发生响应时会使得水凝胶的电位发生变化，从而诱导相邻2-D CCA粒子之间的间隔改变，导致德拜衍射的粒径环改变，实现可视化测量。这种传感器的一个优势在于2-D CCA简便快捷地合成和利用德拜散射环作为一种“显示器”；更重要的是，2-D PC水凝胶在生理离子强度（150mM）的情况下展示 图（6）出对葡萄糖的高敏感性。（图（6）为复合结构的制备流程

13、） 在室温和接近生理离子强度的环境下2-D PC与葡萄糖发生反应，结果如图（7）所示。当葡萄糖的浓度增加时，水凝胶传感器会发生收缩。当葡萄糖浓度增加到0.1mM时，2-D粒子间隔从843nm下降至830nm。当葡萄糖浓度增加到10mM时，间隔降至775nm。总之2-D光子晶体水凝胶在整个人体生理的葡萄糖浓度范围内对葡萄糖显示较高的敏感度。 图（7） 此外，2-D光子晶体水凝胶传感器的颜色会从红色变为黄色，随着葡萄糖浓度的升高逐步转为绿蓝。（a图所示）当可视化检测0.1mM葡萄糖时，散射光颜色会由红变为橙色。人体中除了葡萄糖之外还含有丰富的果糖和半乳糖，在检测葡萄糖时需要排出此类干扰，他们继续做

14、了一组对比实验。从对照实验反映的结果来看，果糖和半乳糖会使2-D光子晶体水凝胶膨胀，粒子之间的间隔变大（b图所示）。膨胀的2-D光子晶体水凝胶仍然会导致散射光颜色的改变，由此也说明了2-D光子晶体水凝胶对葡萄糖检测具有高灵敏度和特异性，今后有望在活体内进行检测。2.4PHPMA(聚羟丙甲丙烯酸甲酯)应用的葡萄糖传感检测7张立强小组发明了一种荧光传感器,用来在单细胞和多细胞水平上研究细胞的代谢。他们用在药物释放上广泛使用的PHPMA作为生物相容性的高分子。这种高分子拥有小部分带正电的PMAETMA结构，确保其具有细胞通透性。葡萄糖探针单体是由HPMA和MAETMA异分子聚合而成。为了减少细胞外复

15、杂的环境对检测精度的影响，Rhod-MA被整合到聚合物传感器中。传感器的合成方法使用的是传统的自由基聚合（如图（8）所示）在DMF体系中将Rhod-MA，GS-MA，HPMA和MAETMA进行异分子聚合。聚合好的 图（8）葡萄糖传感器（G-PS）纯化过程包括：从DMF溶液中沉淀，再到用丙酮除去未发生聚合的单体，最后进行透析。传感器与葡萄糖在PBS缓冲液中的反应结果如图（9）所示。图A中蓝色的最大发射波长随着葡萄糖浓度的增加从445nm逐步变大。同未加葡萄糖相比，加了50nM葡萄糖后在445nm处的荧光强度增强了4.5倍，原因是光诱导了电子转移。来源于罗丹明基团且最大值为580nm的橙色发射波没

16、有显示出对葡萄糖的响应。这意味着合成的探针分子能够用于葡萄糖传感。图B展示的是荧光强度随葡萄糖浓度的变化。在10mM以下，传感器对葡萄糖有相当好的灵敏度，尤其是在0.1mM到5mM之间。在0.1mM到1mM之间，传感器对葡萄糖的响应呈线性关系。正常细胞胞内的葡萄糖浓度可能在 图（9） 0.1mM到5mM之间，这取决于细胞的生理状态，因此我们可以在线性范围内对细胞内的葡萄糖浓度进行监测。该小组还就该传感器对葡萄糖，果糖，半乳糖和甘露糖特异性做了比较。传感器对其他三种糖均有响应，并且对果糖的敏感性最高。考虑到在细胞培养过程中除了葡萄糖之外少有其他糖类物质的加入，所以该传感器对果糖的高灵敏性不会对细

17、胞代谢过程中葡萄糖含量的检测产生影响。总之，以传感器为基础的上述聚合物为细胞内葡萄糖浓度的测量提供了一个灵活的平台，能被扩展到其他传感器应用之中。今后对其更深入的研究是在单个活细胞体内实施葡萄糖的分析检测。2.5PVPBA（聚4- 乙烯基苯硼酸 ）应用于慢性伤口预测8Fransiska S. H. Krismastuti等将PVPBA-SH聚合物嫁接到多孔硅（pSi）反射膜上。聚合物在生理条件下对葡萄糖的反应可以通过用IRS测定EOT的变化和pSiRF的反射率峰值的变化来反映。在检测过程中，pSi-PVPBA表面暴露在pH为7.4的缓冲液中10分钟，然后让处于赫佩斯缓冲液中经10倍稀释的创面积

18、液暴露于表面，稀释后的创面积液的pH为8.1。表面暴露在缓冲液和创面积液中5个循环，然后测定EOT的变化，加过10mM葡萄糖的创面积液也需测量。结果如图（10）a所示。明显地，暴露在创面积液之后pSi-PVPBA的EOT值下降了0.14。由于这种特别的创面积液（WF）样品葡萄糖浓度很 图（10） 低，故EOT值的变化是由于创面积液pH的略微变化引起的；向创面积液中添加葡萄糖后EOT下降的更加明显（下降了0.18）。以上结果说明创面积液的pH应该被调整，以消除其对EOT值的影响。将创面积液的pH调至生理状态（7.4），检测过程和之前相同，得到的结果如图（10）b所示。添加了葡萄糖的创面积液EOT

19、值下降了0.11，原因在于创面积液中添加葡萄糖生成了阴离子硼酸酯；而未添加的仅下降了0.01，这与商业化尺度标准是一致的。这项实验结果说明pSi-PVPBA既对创面积液的pH敏感，也能对葡萄糖发生响应。通过调整pH至生理条件下，可以对创面积液中的葡萄糖进行测定。更进一步发展，该传感平台能够在慢性伤口预测上有所应用。因为葡萄糖的水平是慢性伤口疗愈的指示性物质。3、 结语现阶段，葡萄糖检测在原理上的改进基本没有多大的提升空间了，常用于葡萄糖响应的分子一是苯硼酸，另一个就是葡萄糖氧化酶。从以上近两年的最新研究成果来看，基本没有出现一种新型的分子或材料，能够与葡萄糖发生显著的化学作用，进而被应用于葡萄

20、糖检测。大家所做的工作无非是在苯硼酸或者葡萄糖氧化酶上连接一些功能性的高分子，这样做的好处在于高分子的引入或是增强电极的稳定性，或是提高检测的灵敏度，或是提升抗干扰能力，诸如此类。从这一点给我的感受是：科研工作不一定要在理论研究上有不断的创新，更重要的是要把基础工作做实，能将理论转换为成果，产生实际效应。虽然现阶段对葡萄糖研究不能在理论上有更大的创新和突破，但这也未必不是一件好事。既然已无新原理可求，那大家的研究热点都会回归应用，结合实际，看谁能把葡萄糖的检测做的更快，更准和时间更短。这样的研究工作也正是老百姓或者消费者需要看到的，也正是这样才能推动产业的发展，才能体现出科学应有的应用价值。4、 参考文献1占达东，黎瑞珍，李开鸿.糖的检测.J琼州大学学报，2003-10-28,10（5）.2Z.H.Farooqi,W.T.Wu,S.Q.Zhou and M.Siddiq,Macromol,Chem.Phys.,2011,212,1510-1514.3D.Roy and B.S.Sumerlin,ACS Macro Lett.,2012,1,529-532.4K.T.Kim,J.Cornelissen,R.Nolte and J.van Hest,Adv.Mater.,2009,21,2787.5Ha