人骨髓间充质干细胞分离鉴定方法的改进

1、人骨髓间充质干细胞分离鉴定方法的改进         08-03-08 15:29:00     编辑：studa20       作者：吴洁莹，廖灿，许遵鹏，陈劲松，辜少玲【摘要】  本研究的目的是建立一种基于临床移植需要的分离、培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的方法，为配合造血干细胞移植的临床应用提供实验基础。采用Percoll分离液（1.073 g/

2、ml）从新鲜成人骨髓穿刺液中分离MSC，应用贴壁筛选法传代培养，流式细胞仪检测细胞表面抗原，成骨诱导体系（地塞米松0.1 mol/L、-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50 mol/L）及脂肪诱导体系（地塞米松1 mol/L、牛胰岛素5 mg/L、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤0.5 mmol/L、消炎痛60 mol/L）分别诱导MSC定向分化，通过细胞形态观察及免疫化学染色进行鉴定。 结果表明： 从成人骨髓液中分离培养出MSC，稳定表达CD73、CD105、CD166，不表达CD34、CD45。定向诱导的成骨细胞表达碱性磷酸酶活性，脂肪细胞内出现明显的脂滴。结论：采用密度梯度离心联

3、合贴壁筛选法并通过流式细胞术检测及定向诱导分化，能够从成人骨髓液中分离出MSC，并完成细胞表型及多向分化潜能的初步鉴定。本操作方案具有一定的临床应用价值。 【关键词】  间充质干细胞A modified Method to Isolate and Identify the  Adult Mesenchymal Stem Cells from Human Bone MarrowAbstract  The study was aimed to establish a protocol of isolating and culturing adult mesenchym

4、al stem cells (MSC) from human bone marrow aspirate and identify them by surface antigen analysis and committed differentiation in order to provide an experimental foundation for achieving a therapeutic benefit in applying MSC in hematopoietic stem cell transplantation.  MSCs were obtained from

5、 fresh human bone marrow aspirate by gradient centrifugation with Percoll (1.073 g/ml) and anchoring culture in L-DMEM with 10% fetal bovine serum by a full medium exchange every 3 days. The MSC surface antigens，including CD34，CD45，CD73，CD105，CD166，were analyzed on FACScan flow cytometer.  Unde

6、r culture in conditioned medium for osteogenesis (the hormone cocktail containing 0.1 mol/L dexamethasone，10 mmol/L glycerol-2-phosphate and 50 mol/L ascorbic acid) and adipogenesis (the cocktail containing 1 mol/L dexamethasone，5 mg/L insulin，0.5 mmol/L 1-methyl-3-isobutylxanthine and 60 mol/L indo

7、methacin)，MSCs committedly differentiated into osteoblasts and adipocytes. The differentiated mesenchymal stem cells were identified by morphological observation  and immunohistochemical staining. The results showed that  by gradient centrifugation and adhesion culture，MSCs could be isolat

8、ed and culture-expanded from human bone marrow aspirate. These cells were   uniformly negative for CD34，CD45 and positive for CD73，CD105 and CD166. The osteogenic differentiated cells were positive for alkaline phosphatase (ALP) and the adipogenic differentiated cells displayed accumulatio

9、n of lipid vacuoles，as detected by oil red O. It is concluded that  MSC can  be isolated and expand-cultured from adult human bone marrow aspirate and committedly differentiate into osteoblasts and adipocytes. MSC primary identification can be accomplished by  flow cytometry and induc

10、ed differentiation. The set of methods in current experiment shows somewhat practical value for basic research and clinical application.Key words  mesenchymal stem cell; isolation  method; identification method;  cell culture; committed differentiation间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）

11、是最早自骨髓中分离出的一类具有自我更新及多向分化潜能的组织干细胞1。作为多种骨髓基质细胞的祖细胞，MSC具有稳定和修复造血微环境，促进造血干细胞增殖、分化，调节淋巴细胞免疫功能，减轻移植排斥反应等生物学效应2。MSC的发现为针对性解决造血干细胞移植，尤其是脐血移植中的干细胞数量相对不足及减少移植物抗宿主病提供了一个有效途径3，4。本研究旨在建立一种从成人骨髓组织中分离、培养、扩增MSC的简便易行的方法，通过流式细胞仪检测细胞表面抗原和定向诱导分化，完成对获得细胞的初步鉴定，为干细胞移植的临床治疗及组织损伤修复工程提供实验基础。材料和方法材料与试剂骨髓穿刺液5 ml取自于健康成人移植供者，肝素抗

12、凝，4保存。分离培养试剂：Percoll 细胞分离液（1.073 g/ml，Pharmacia产品），MSC专用培养基MesenCultTM （MSC basal medium and mesenchymal stem cell stimulatory supplements，Stem cell产品）和胎牛血清（FBS，Stem cell产品），低糖及高糖DMEM培养基（Dulbeccos modified Eagle medium，Gibco BRL产品），胰蛋白酶（Sigma产品）；诱导试剂：地塞米松（dexamethasone）、-甘油磷酸钠（-glycerol-2-phosphate

13、disodium salt）、抗坏血酸磷酸盐（ascorbic acid-2-phosphate salt）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰岛素（insulin）、消炎痛（indomethacin）及碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒均为Sigma产品；流式相关抗体：鼠抗人单克隆抗体CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD166-PE（BD PharMigen产品）、CD105-FITC（SEROTEC产品）。主要仪器：细胞培养板、细胞培养瓶（Corning）；超净工作台（广州医学生物工程研究所，GX-型），细胞培

14、养箱（WTC binder），流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson产品），倒置显微镜、照相机（Olympus），荧光显微镜、数码相机（Nikon），低温冷冻离心机（IEC centra）。方法人骨髓MSC的分离培养与传代 无菌条件下用等量PBS稀释肝素抗凝骨髓液，在10 ml消毒离心管中加入6 ml  Percoll分离液，再将4 ml稀释的骨髓液小心加至分离液表面，820×g离心20分钟；吸取分界面的白色絮状细胞层，用低糖DMEM培养基混匀，300×g离心10分钟，洗涤2次。按2×105/cm2密度接种于含MS

15、C专用培养基的75 cm2培养瓶，37、5% CO2培养箱全湿条件下培养48小时，全量换液，去除血细胞及其它未贴壁成分。用含10 FBS的低糖DMEM培养基维持培养。根据细胞生长情况，每3天全量换液。细胞融合达80以上，加入0.10%-0.15%胰蛋白酶-EDTA溶液2.5 ml消化，按14或15传代。取3代以上的细胞进行实验。MSC表面抗原的检测 取第3代生长达80%融合的贴壁细胞，用胰蛋白酶消化，计数后取2 ×106个细胞，分装6管，每管加入10 l荧光标记抗体CD45-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD105-FITC、CD166-PE，另设1管为空白对照，室温避光30分钟；用PBS反复洗2-3次，减少非特异性结合；加入200 l  PBS混匀细胞，并以1%多聚甲醛固定，4保存，24小时内上流式细胞仪检测。定向诱导MSC向成骨细胞分化的方法与鉴定 收集消化后细胞，按3 000 cells/cm2接种于6孔板或24孔板，待多数细胞贴壁后，换用含10FBS的高糖DMEM培养液，加入成骨诱导体系：地塞米松0.1  mol/L、-甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50 mol/L，每3天全量换液，维持2-3周。用碱性磷酸酶试剂盒染色。定向诱导MSC向脂肪细胞分化