痛必定注射液对慢性结扎损伤模型大鼠脊髓背角c-fos和P物质的影响

1、痛必定注射液对慢性结扎损伤模型大鼠脊髓背角c-fos和P物质的影响         08-05-16 15:12:00     作者：张昊旻    编辑：studa20【摘要】  目的痛必定注射液是具有良好镇痛效果的中成药，拟通过本实验研究了其镇痛机理。方法采用免疫组化的方法，研究痛必定注射液对CCI（慢性结扎损伤）模型大鼠脊髓背角c-fos基因表达和P物质含量的影响。结果痛必定注射液能明显降低CCI大鼠脊髓背角c-fos基因

2、和P物质含量。结论该实验证实了痛必定注射液对CCI大鼠具有很好的镇痛作用，减少脊髓背角神经元对传入的伤害性刺激的反应,可能是其发挥镇痛作用的途径之一。 【关键词】  痛必定注射液 c-fos P物质 免疫组化    痛必定注射液是由4种中药（有效成分或部位）组成的具有良好镇痛作用的中成药。其动物实验和临床应用均显示和度冷丁1，2有相似的镇痛效果，但无明显成瘾性。其镇痛作用产生的机理尚未完全清楚，且近年来研究表明，外周伤害性刺激等因素可激活脊髓内即刻早期基因c-fos并表达fos蛋白36；P物质(substance P ,SP)被认为是脊髓伤害性信息传递物

3、质7,在脊髓痛觉信息传递过程中发挥着重要的作用8，二者是疼痛在分子水平的标志。本实验运用免疫组化方法研究了痛必定注射液对CCI（chronic constriction injur，慢性结扎损伤）模型大鼠脊髓背角浅层c-fos基因表达和SP含量的影响，初步探讨痛必定注射液的镇痛机理。1  材料1.1  动物成年Wistar大鼠，雌雄各半，体重（200±20） g，由吉林大学实验动物中心提供。1.2  主要试剂痛必定注射液40 mg/支，加入生理盐水2 ml，即成为浓度20 mg/ml溶液。按20 mg/kg体重剂量腹腔注射。兔抗大鼠c-fos多克隆抗体(

4、Santa CruzBiotechnology Inc. USA ,北京中山技术有限公司分装)，SP免疫组化染色试剂盒为武汉博士德生物技术有限公司产品，DAB染色试剂盒为北京中山技术有限公司产品，曲拉通X-100(Triton-100)为北京中山生物技术有限公司产品。2  方法2.1  分组、用药、造模Wistar大鼠30只，随机分成A（正常组）、B（CCI造模组）、C（CCI+痛必定）3组。将B组和C组大鼠在无菌条件下1%异戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，暴露左侧的坐骨神经干，在中部45 mm范围内，用4-0号铬制羊肠线打34个结，以引起小腿微微抽动为宜，然后逐层

5、缝合。另一侧行假手术。14 d后用特制大鼠固定笼固定大鼠，SHXYT型小型动物压痛仪（深圳凯强利股份有限公司），分别测量双侧后肢的痛阈值，左侧痛阈显著降低，并结合行为学改变，认为造模成功。C组按20 mg/kg体重剂量连续5 d腹腔注射痛必定注射液，B组同时给予同剂量生理盐水。2.2  取材、切片1%异戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，快速开胸，暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，进行心脏灌注。先以无菌生理盐水100 ml快速冲去血液，至流出的液体变清亮，随后用4含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)先快后慢灌流固

6、定约30 min。打开脊柱，取脊髓L3L5节段置于4含40 g/L多聚甲醛PBS中后固定4 h , 再移入4含300 g/L蔗糖的0.1 mol/L PBS(pH7.4)中直至组织沉底。冰冻切片机-20冠状连续切片，片厚5 m。选取结构完整者贴于APES处理过的玻片上。2.3  免疫组织化学反应2.4  免疫组化对照实验非特异性对照用正常羊血清代替c-fos或SP抗体，阴性对照用PBS代替c-fos或SP抗体,其它步骤同上。2.5  图像观察、分析用Olympus显微镜观察每一张切片，Fos蛋白的测定方法采用免疫阳性（F-LI）神经元计数法，用低倍镜下每张切片脊髓

7、背角所有F-LI数目表示数量（五张切片，取均值；单位：个）。SP的结果采用北京航空航天大学图像中心研制的CMIAS-多功能真彩色病理图像分析系统（版本4.0）进行分析，每张切片中SP免疫活性物质（SP-LI）阳性面积值（五张切片，取均值；单位：阳性单位）。2.6  统计学方法采用SPSS 9.0软件，数据用均数±标准差(±s)表示，组内比较用t检验；组间比较用单因素方差分析，并以q检验比较两两差异，P0.05认为差异显著。3  结果3.1  fos蛋白表达情况F-LI阳性神经元呈棕黄色，定位于细胞核，呈圆形或卵圆形，胞浆和核仁均不染色或染色较浅

8、，易与周围背景区别开来。光镜下见脊髓背角浅层内有大量的fos免疫反应。结果显示：B组脊髓背角F-LI神经元数目明显高于正常组(P<0.01，t=16.381)；与B组比较，C组左侧脊髓背角的F-LI神经元数目明显降低(P<0.01，t=7.564)。免疫组化染色所显示的对照实验均呈阴性反应(见表1)。3.2  P物质含量情况光镜下可见SP免疫阳性反应物主要分布于脊髓背角浅层,以外侧带最为浓密。脊髓的其他部位不着色或呈淡黄色。计算机图像分析检测结果显示:B组脊髓背角SP-LI的含量明显高于右侧和正常组(P<0.01，t=8.576)；与B组比较，C组大鼠脊髓背角的SP-LI含量明显降低(P<0.01，t=9.258，见表1)。表1  各组大鼠脊髓背角浅层F-LI和SP-LI含量比较（略）4  讨论    原癌基因c-fos是一种存在于正常神经元细胞核内的即刻早期基因，fos是其蛋白表达产物。正常情况下，