去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损

1、去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损    【摘要】  目的：研制理想的能够修复骨缺损的骨材料，为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。方法：体 外扩增诱导兔骨髓基质干细胞，将其与去细胞牛松质骨复合培养。造成兔桡骨中段 10 mm 骨缺损模型，分复合细胞组、单纯材料组、空白对照组。通过大体观察、放射学检查、组织学检查观察骨缺损的修复情况。结果：去细胞牛松质骨复合骨髓基质干细胞修复兔桡骨缺损，12 周时缺损区完全被新骨代替，骨髓腔完全通畅，优于单纯材料组的修复效果，单纯材

2、料组优于空白对照组。结论：去细胞牛松质骨具有良好的成骨能力，有可能成为理想的骨支架材料。【关键词】  骨修复材料；去细胞牛松质骨；组织工程    Abstract    Objective     To  prepare  an  ideal  scaffold  material  for  the

3、0; repair  of  bone  defect,  for  the  clinical  use  in  the  bone  reconstruction  field.    Methods     Rabbit  marr

4、ow  stem  cells  (MSCs)  were  cultured  and  expanded  in  vitro.  The  MSCs  were  mixed  with  acellular  bovine  cancellous

5、60; bone  (ABCB).  The  rabbits  were  prepared  as  model  of  bone  defects,  divided  into  3  groups:named  complex  group, &#

6、160;acellular  bovine  cancellous  bone  group,  and  blank  control.  The  animals  were  sacrificed  and  new  bone  regeneration  in 

7、; the  defects  was  investigated  by  gross  specimen  inspection,  X-ray  examination  and  histological  observation.    Results    

8、 At  12  weeks,  the  radial  defects  repaired  by  named  complex  group,  and  their  marrow  cavities  formed,  which  is

9、  better  than  acellular  bovine  cancellous  bone  group.  Acellular  bovine  cancellous  bone  group  is  better  than  blank  

10、control.    Conclusion     Acellular  bovine  cancellous  bone  may  be  used  as  a  kind  of  ideal  scaffold  material.

11、60;   Key  Words    Bone  repair  material;  Acellular  bovine  cancellous  bone;  Bone  tissue  engineering    研制理想的生物材料替代自体骨移植用于修复骨组织缺损是医学和生物材料

12、科学领域的一个重要课题。目前临床上应用的骨移植物较多，如羟基磷灰石、脱钙骨、脱蛋白骨等为临床骨缺损的治疗提供了很多选择。但是这些方法各有优缺点，难以满足临床上修复各种骨缺损的需要。去细胞牛松质骨作为新型的生物衍生支架材料，具有良好的力学性质、空间结构、降解性、生物相容性等特点，日益受到重视。本研究将兔骨髓间充质干细胞（MSCs）与去细胞牛松质骨载体相结合，构建组织工程骨，探索修复兔桡骨节段性骨缺损的可行性。    1    材料与方法    1.1  &#

13、160; 材料    1.2    方法    2    结    果    2.1    原代细胞培养    原代细胞接种后，细胞漂浮在培养液表面，呈圆形，细胞 6 h 后开始贴壁，24 h 内有少数细胞贴壁，48&#

14、160;h 后贴壁细胞增多，形状不一。约 6 d 时形成细胞集落，约 10 d 后长满。1:2 传代后增殖加快，细胞呈均一的长梭形，呈漩涡状生长（图 1）。    2.2    相差显微镜观察    BMSCs 在材料上接种孵育 2 h 后，材料周边开始有细胞黏附，随着时间延长，附着材料上的细胞逐渐增多；培养 1 周后，细胞在材

15、料上逐渐伸出突起，连接在骨小梁之间，可见大量细胞附着于材料的孔隙及材料周边。    2.3    扫描电镜观察    可见 ABCB 材料上皆有细胞附着，细胞呈梭形或多角形，有的细胞表面可见钙颗粒沉积，有的材料上的细胞呈团簇状，周围有网状胶原附着。2.4    VON Kossa 染色    显微镜下见诱导组细胞间可见黑色斑点状被染色的钙基质；未诱导组未见黑

16、色斑点状被染色的钙基质。    2.5    骨缺损修复实验    3    讨    论    理想的骨组织工程细胞外基质材料应具有良好的生物相容性和可降解性、合适的三维多孔结构、较强的骨诱导性、良好的可塑性和适当的机械强度，尤其是作为管状骨的修复材料2。提供移植的材料多种多样，但理想的骨缺损修复材料，尤其是修复大段骨缺损的移植材料仍是骨科面临的重要课题。

17、异种骨由于来源广泛和经济简便，在解剖形状、组织结构等方面具有无法比拟的优越性，一直是骨修复工作者热衷于研制开发的植骨材料，然而异种骨的免疫排斥反应妨碍植骨与骨缺损区域直接接触，破坏植骨成分，导致植骨吸收。    如何消除异种骨的抗原性，同时保留其成骨能力，是异种骨移植的核心问题。罗卓荆3等通过对松质骨抗原性的研究发现，在骨小梁骨基质染色阴性，而骨细胞、成骨细胞、软骨细胞及骨陷窝等均有不同程度的阳性染色。也就是说，各种细胞成分是松质骨中抗原的主要成分。常用的去细胞方法有酶消化法、渗透溶液法和去污清洗法。笔者采用 10% 高渗生理盐水和去

18、污剂 TritonX-100 联合对牛肱骨进行组织工程学的去细胞处理。去细胞基质骨有效地去除异种骨引起免疫排斥反应的细胞成分，清洁骨陷窝壁，选择性地保留抗原性相对较弱的网状骨基质结构，降低了移植骨的免疫原性。    为了寻求理想的修复材料，课题组采用自制的去细胞牛骨作为兔骨髓基质干细胞载体复合移植于体内骨缺损处，以观察其成骨潜能和吸收降解情况，旨在为今后的实验和临床应用提供依据。    MSCs 是骨髓中的一类多能干细胞，具有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞甚至神经细胞等多种潜能，可

19、在地塞米松、维生素 C、- 甘油磷酸钠等诱导下向成骨细胞分化，是构建组织工程骨的重要细胞 。应用 MSCs 修复骨缺损的组织工程方法一般是将 MSCs 与支架材料复合后植入缺损区，或先将 MSCs 诱导分化为成骨细胞后再与支架材料复合并植入缺损区。我们所采用的将 MSCs 诱导分化为成骨细胞后和去细胞牛骨复合在一起的方法，此前尚未见报道。    以往的研究发现：生物衍生骨孔隙率高，可有效地为种子细胞黏附、分化和成骨提供良好场所。生物衍生骨植入骨缺

20、损区后，随着诱导成骨作用、骨传导作用的完成而逐渐降解，其逐步降解的特点与新骨形成的过程相吻合。本实验中将骨髓基质干细胞诱导培养后，接种于支架材料上，植入骨缺损处，发挥其最大成骨活性。在体内微循环环境影响、应力作用及血液供应等条件下，组织工程骨可同时发挥骨传导、骨诱导成骨作用，从而修复骨缺损。通过放射学检查、大体观察及组织学检查均表明，组织工程骨的成骨及塑形能力较强。4、8 周复合细胞组有大量骨痂形成 ，12 周时骨塑形好，提示组织工程骨成骨较快，新骨塑形、改建迅速；而单纯材料组只是通过支架材料的骨传导作用促进成骨，所以新骨形成较慢；空白对照组各缺损区均未愈合。    寻找能同时满足生物相容性良好、有利于细胞黏附生长、且有一定的孔隙率并具备相当的降解速率的生物支架材料是组织工程的重点。本文作者认为用骨髓基质干细胞复合去细胞牛松质骨构建的组织工程骨移植修复骨缺损，排斥反应少，能促进负重部位长段骨缺损修复，此方面的深入研究将为骨组织工程的临床应用提供重要的理论依据。笔者通过一系列理化方法处理的去细胞骨，降低或消除了移植骨的免疫原性，具有良好生物相容性，但仍保留骨的天然属