基因工程第七章DNA定点诱变

1、第七章 DNA定点诱变site-directed mutagenesis of cloned DNA定点诱变随机诱变(molecular evolution) 易错PCR(erro-prone PCR) DNA重排(DNA shuffing)体外随机引发重组(random-priming in vitro recombination)交错延伸(stagger extension process，StEP)突变方式突变类型单个碱基的置换 (base substitution)简单的插入或缺失 (insertion or deletion)系统的缺失、插入或成串碱基的置换第一节 寡核苷酸介导的诱变

2、oligonucleotide-mediated mutagenesis 70年代初 174 DNA(ss DNA 5386bp), 当用带琥珀突变的 ss DNA与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时, 观察到“标记获救”现象,即产生带野生型基因组的噬菌体野生型DNA片段突变体174 DNA+退火异源双链体宿主编码的错配修复系统全长的野生型基因组可利用突变的DNA片段将突变引入到野生型DNA中M. Smith1993年诺贝尔化学奖加拿大生物化学家 1932年出生于英国，毕业于英国曼彻斯特大学，1956年移居加拿大。现任加拿大温哥哥华大不列颠哥伦比亚大学生物技术实验室主任。 1978年发明了寡

3、聚核苷酸定点诱变技术。利用寡聚核苷酸定点诱变技术，可以人为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质分子之间的相互作用。一、Kunkel 法 或称“U”法 dut- dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP, 因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置一、Kunkel 法 或称“U”法1背景知识 dut- dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP, 因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据

4、的位置一、Kunkel 法 或称“U”法ung- UDG酶缺陷, UDG酶尿嘧啶(uracil) -N-糖基化酶(glycosylase)可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基1背景知识E.coli (dut- / ung- ) 合成的 DNA含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基E.coli CJ236 dut, ung, thi, relA; pCJ105(Cmr) pCJ105 is a F plasmid ss DNA 制备载体ss DNA 制备载体单链噬菌体载体 phagemid载体UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA转化 E.co

5、li CJ236M13K07感染Isolate phagemid ss DNA与突变寡核苷酸退火T4 DNA polymeraseDNA ligase转化MV1190 (dut+/ung+)2原理原理只有突变链能复制2原理原理2原理原理Insert target DNA2原理原理UUUUUInsert target DNA转化 E.coli CJ2362原理原理UUUUUUUUUUInsert target DNA转化 E.coli CJ236M13K07感染2原理原理UUUUUUUUUUInsert target DNA转化 E.coli CJ236M13K07感染Isolate phage

6、mid ss DNA与突变寡核苷酸退火2原理原理UUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA转化 E.coli CJ236M13K07感染Isolate phagemid ss DNA与突变寡核苷酸退火2原理原理UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA转化 E.coli CJ236M13K07感染Isolate phagemid ss DNA与突变寡核苷酸退火T4 DNA polymeraseDNA ligase2原理原理UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA转化 E.coli CJ236M13K07感染

7、Isolate phagemid ss DNA与突变寡核苷酸退火T4 DNA polymeraseDNA ligase转化E.coli MV1190 (dut+/ung+)2原理原理UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA转化 E.coli CJ236M13K07感染Isolate phagemid ss DNA与突变寡核苷酸退火T4 DNA polymeraseDNA ligase2原理原理只有突变链能复制转化E.coli MV1190 (dut+/ung+)UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA转化 E.coli CJ2

8、36M13K07感染Isolate phagemid ss DNA与突变寡核苷酸退火T4 DNA polymeraseDNA ligase2原理原理只有突变链能复制转化E.coli MV1190 (dut+/ung+)(1) DNA polymerase T4 T7 Klenow 65% 11/13 36% 突变率 (84.6%) 3. 酶(1) DNA polymerase T4 T7 Klenow (可能会替换引物) 65% 11/13 36% 突变率 (84.6%) 3. 酶(1) DNA polymerase T4 T7 Klenow (可能会替换引物) 65% 11/13 36% 突

9、变率 (84.6%) (2) ligase 3U/13l 可有可无，有则效率高 3. 酶(1) DNA polymerase T4 T7 Klenow (可能会替换引物) 65% 11/13 36% 突变率 (84.6%) (2) ligase 3U/13l 可有可无，有则效率高 (3) T4 gene 32 protein 提高含二级结构的ssDNA的突变率3. 酶4. primers要求5端磷酸化 引物的终极条件：与靶DNA正确配对特异性地与靶DNA序列退火 A. 单核苷酸置换插入 or 缺失5端完全配对，使得上游(引物)起始的DNA合成不容易将诱变寡核苷酸取代，约需8-10bp3端所形成

10、的杂交体足以引导DNA合成。如果错配核苷酸太靠近3端，3端将不能形成稳定的杂交体，易被外切活性降解。所以3端需有7-9bp完全配对;为便于筛选，应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核苷酸。一般17-19bp, 错配在中央，使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间的热稳定性差异足够大。 B. 多处缺失或变换2个bp以上的oligo 两侧需12-15bp 侧翼双链区的Tm应约为35-40 Tm=4(G+C)+2(A+T) =36 ( 3 each)突变区域大, 效率越低(两侧形成稳定杂交体的能力是突变区长度的函数 越低）5. 模板/结果 靶DNA尽可能短，应测序确定其突变 二、二、Altered

11、Sites II in vitro mutagenesis system位点选择定点诱变法 三、三、Transformer Site-Directed mutagenesis转化子诱变法 Synthesize second strandDigest DNA (primary digestion)Transform E.coli mutS to propagate plasmidsIsolate and digest (Second digestion)Transform E.coliIsolate DNA四 、 PCR定点诱变1同源重组法2DpnI法3.重叠延伸 Overlap extensi

12、on对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链五、SOE 重叠延伸剪接术 Splicing by overlap extension可用于将两个 DNA片段在所期望的位点进行连接 设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在3末端，起引物作用；重叠部分在5末端，与待融合的DNA片段序列互补。 设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补ATGATGATGATGATGATGEcoRIBamHIBamHIATGEcoR

13、IATGBamHIATGEcoRIPCRPCR重叠延伸PCR第二节 嵌套缺失第二节 嵌套缺失1. 外切核酸酶III的消化Exonuclease III5353532. BAL 31的消化 主要活性为3外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3端去掉除单核苷酸， 还是一个内切核酸 (单链，nick, gap) 依赖 Ca+ EGTA可抑制活性AABA digestionvectorinsertBAL 31B digestionDeleted inserts cloned to plasmid vector3. DNase I 的消化内切酶，可优先嘧啶核苷酸水解 ds or ss DNAMg2+:

14、独立作用于每条DNA链，位点随机Mn2+: 大致在同一位置切割dsDNA 产生平端 或1-2个核苷酸突出ccc DNADNase I, Mn+ (low concentration)A digestionKlenow re-ligationEcoRIHindIIIStyIStyIScaIClaIHindIIISalIFspIClaIFspIKpnIEcoRI 1 660 950 1850 2100 2260 2700 3400 3430 3800 6000 6600 22306.6kbpR-1600 (1.6kb)pR-2260 (2.26kb)pR-2450 (2.45kb)pR-2570 (2.57kb)pR-2700 (2.7kb)pR-3300 (3.3kb)pR-3400 (3.4kb)pR-3740 (3.74kb)pD