第四讲基因工程

1、第四讲基因工程一、基因工程定义一、基因工程定义 1.定义 基因工程是指将外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。 2.基因工程核心技术： DNA克隆技术（又称为DNA重组技术、分子克隆技术）具体过程：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体）。基因克隆的技术路线基因克隆的技术路线 基因基因 载体载体体外重组体外重组重组子（杂合重组子（杂合DNA）转化转化受体细胞受体细胞筛选阳性克隆筛选阳性克隆大量扩增，获得子代大量扩增，获得子代DNA 基因克隆示意图基因克隆示意图目的基因 载体DNA(限制性内切

2、酶切开)重组体宿主细胞已转化的宿主细胞（蛋白质）3.基因工程要件 工具酶 （限制性内切酶、连接酶、聚合酶等） 目的基因（外源基因） 载体 （质粒、噬菌体DNA等） 受体细胞 （大肠杆菌、酵母菌、动物细胞等）基因工程、遗传工程、基因操作、重组DNA技术、基因克隆、分子克隆重组重组DNADNA技术进展技术进展1973 Cohen第一例成功的克隆实验1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 1993 基因工程西红柿在美国上市基因工程西红柿在美

3、国上市 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、发酵工程。酶工程、细胞工程、发酵工程。 其中基因工程是核心。其中基因工程是核心。胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体4.4.基因工程与医学的关系基因工程与医学的关系 分子医学分子医学 molecular medicine（1）疾病基因的发现（2）发展生物制药基因工程药物基因工程疫苗（3）DNA诊断 基因诊断 基因诊断用分子生物学

4、的技术对引起疾病的原因-遗传基因,致病微生物和寄生虫,以及某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞遗传基因的检测和分析. DNA/RNA（4）基因治疗 gene therapy 就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗 的目的。1.基因置换2. 基因修正3. 基因修饰 产物补偿缺陷细胞4. 基因失活 反义技术封闭基因,抑制有害基因对象 体细胞 生殖细胞1990.9.14 首例基因治疗4岁 女孩 严重免疫缺陷症(SCID) 缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA) 2-脱氧腺苷含量升高 毒性 严重破坏免疫功能治疗：ADA基因 LN逆转录病毒载体 靶细胞为病人淋巴细胞 回输

5、截止1996年6月，世界上接受体细胞基因疗法的患者已达1537例，说明体细胞基因治疗的技术路线具有较大的可操作性。杰辛格事件杰辛格事件 1999年公布：18岁的亚利桑那州高中毕业生泽西杰辛格因患鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OTC）部分缺陷症在宾夕法尼亚大学接受基因治疗。该校基因治疗研究所的研究者采用导管经腹股沟动脉直及肝血管，将携带校正基因的重组腺病毒导入肝脏，外源基因的表达可望校正OTC缺陷所导致的高血氨症。基因治疗4天后，杰辛格出现发烧、凝血而死亡。二、基因工程常用工具酶二、基因工程常用工具酶 常用的工具酶：常用的工具酶：限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3- 5磷酸二酯键DNA聚合酶探

6、针标记、补平3末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现阿尔伯阿尔伯(Arber)(Arber)、史密斯、史密斯(Smith)(Smith)和内森斯和内森斯(Nathans)(Nathans)，获获19781978年诺贝尔生理学和医学奖年诺贝尔生理学和医学奖（一）限制性内切酶1. 1.作用：作用： 识别双链识别双链DNADNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键内部特异位点并裂解磷酸二酯键2.2.命名：命名：EcoREcoR(E E：属名；：属名；coco：种名；：种名；R R：株；：株；：发现次序：发现次序)

7、 ) (Escherichia coli 大肠杆菌）3.3.分类：分类：型型: :识别特定位点，随意切割。识别特定位点，随意切割。 型：识别特定位点，并在位点内切割型：识别特定位点，并在位点内切割 （应用最广泛） 型型: :识别特定位点，附近切割。识别特定位点，附近切割。核酸的结构核酸的结构4.4.识别和切割位点特点识别和切割位点特点回文结构回文结构 4 48 bp8 bp产生两种末端产生两种末端 粘性末端粘性末端 粘端粘端 平头末端平头末端 平端平端 如：如： GGATCC CCTAGGEcoRGAATTCCTTAAG5533553355G GCTTAACTTAAAATTCAATTCG G3

8、33355粘性末端粘性末端SmaCCCGGGGGGCCC5533335555CCCCCCGGGGGGGGGGGGCCCCCC333355平头末端平头末端粘性末端与平头末端粘性末端与平头末端续表续表pBR322Eco RHind Bam HAva Pvu Sal Pst O r i 氨苄青霉素 抗性基因 四环素抗性基因DNA酶切消化与电泳分析同工异源酶：来源不同但能识别和切割同一位点同工异源酶：来源不同但能识别和切割同一位点 同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端 BamHIBamHI、BclIBclI、BglIIBglII、Sau3AISau3AI

9、和和XhoIIXhoII就就 是一组同尾酶是一组同尾酶, ,它们切割它们切割DNADNA分子后都形分子后都形 成成GATCGATC四个核苷酸形成的粘性末端。四个核苷酸形成的粘性末端。 同尾酶DNADNA上的酶切位点上的酶切位点 pUC18与 pUC19的多克隆位点序列 5、影响限制性核酸内切酶消化的因素 DNA的纯度 DNA甲基化程度 温度 缓冲液 ：Mg2+（二）（二）DNADNA连接酶连接酶1.功能：催化DNA双链5磷酸基与3羟基之 间形成磷酸二酯键。2.种类：T4DNA连接酶、细菌DNA连接酶。3.作用温度：最适37，通常16左右。DNA聚合酶聚合酶Taq DNA聚合酶聚合酶逆转录酶逆转

10、录酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶（三）修饰酶1 1。DNADNA聚合酶聚合酶(pol )(pol )的活性的活性5533的聚合活性的聚合活性5 35 3方向方向核酸核酸 外切酶活性外切酶活性5 35 3外切酶活性外切酶活性3 53 5外切酶活性外切酶活性pol pol 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段大片段 （KlenowKlenow片段）：聚合活性、片段）：聚合活性、 3 53 5外切外切活性活性 常用的工具酶用于测序、探针标记等。2 2。Taq DNATaq DNA聚合酶：聚合酶： 耐高温，具有聚合及耐高温，

11、具有聚合及3 53 5外切酶活外切酶活性。常用于性。常用于PCRPCR扩增。扩增。三、基因工程载体三、基因工程载体（一）定义：（一）定义： 能将有用基因携带至宿主细胞并可在其中能将有用基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的遗传因子。自主复制的遗传因子。 即：能携带靶即：能携带靶DNADNA进入宿主细胞进行扩增和进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。其本质是表达的工具。其本质是DNADNA。 （二）理想克隆载体的条件（二）理想克隆载体的条件 能自主复制和增殖能自主复制和增殖 易进入宿主细胞易进入宿主细胞 有合适的酶切位点方便组装外源有合适的酶切位点方便组装外源DNADNA 具有筛选标志和识别指标具有

12、筛选标志和识别指标（三）种类：（三）种类： 质粒 噬菌体DNA 病毒DNA1.质粒载体 质粒质粒细菌染色体以外的，能自主复细菌染色体以外的，能自主复制的，与细菌共生的，同时对细菌的表制的，与细菌共生的，同时对细菌的表型有一定影响的遗传物质。型有一定影响的遗传物质。 特点特点双链环形双链环形 严紧复制或松弛复制严紧复制或松弛复制 对宿主存活不必需对宿主存活不必需 人工质粒载体 严紧型质粒载体 松弛型质粒载体类型：类型： 天然质粒载体例例 1 pBR322pBR322Eco RHind Bam HAva Pvu Sal Pst O r i 氨苄青霉素 抗性基因 四环素抗性基因特点：特点：分子小，松

13、弛型分子小，松弛型含常用酶切单切点含常用酶切单切点有有AmpAmpr r和和TcTcr r抗性基抗性基因作为筛选标记因作为筛选标记例例 2 pUC18（多克隆（多克隆 位点）位点） pUC18与 pUC19的多克隆位点（多种酶切口、单一酶切点）序列 2、噬菌体载体噬菌体载体 结构特点结构特点 a、线性双链、线性双链DNA分子，分子， b、其末端有、其末端有12bp的互补单链，称为的互补单链，称为cos位点，是位点，是DNA包装成为噬菌体颗粒不可缺少的序列。包装成为噬菌体颗粒不可缺少的序列。 野生型野生型噬菌体的噬菌体的cos位点序列为：位点序列为： CCCGCCGCTGGA5 5GGGCGGCGACCT噬菌体噬菌体(phage)基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区右侧区DNA，替换型载体，外源，替换型载体，外源DNA：923kb常用：常用：EMBL 系列、系列、 gt 系列、系列、charon系列系列科斯质粒科斯质粒(cosmid)： DNA的的 cos区区+质粒，双链质粒，双链 环状环状DNA，克隆容