现代食品分析技术

1、March 2, 2022 实时荧光定量PCR介绍宝生物工程（大连）有限公司宝生物工程（大连）有限公司主主 要要 内内 容容Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识12Real Time PCRReal Time PCR实验方法实验方法3Real Time PCRReal Time PCR解析方法解析方法4Real Time PCRReal Time PCR应用实例应用实例实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 2March 2, 2022March 2, 2022Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1. Real Time PCR

2、的用途及原理2. Real Time PCR的检测方法Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3 3March 2, 2022March 2, 2022Real Time PCR的用途的用途病毒及病原菌定量分析病毒及病原菌定量分析导入基因拷贝数解析导入基因拷贝数解析GMO定量检测定量检测差异显示结果验证差异显示结果验证基因芯片结果验证基因芯片结果验证siRNA效果确认效果确认mRNA表达量分析表达量分析病毒及病原菌检测病毒及病原菌检测物种鉴定物种鉴定基因分型基因分型实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4 4March 2,

3、2022March 2, 2022Real Time PCRReal Time PCR的原理的原理 激激发发光光发发射射光光使用使用Real Time PCRReal Time PCR扩增装置实时监测扩增装置实时监测PCRPCR扩增产物并进行分析的方法。扩增产物并进行分析的方法。Real Time PCRReal Time PCRCtCt值值实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍5 5March 2, 2022March 2, 2022Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1. Real Time PCR的用途及原理2. Real Time PCR的检测方法Rea

4、l Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍6 6March 2, 2022March 2, 2022TaqManTaqManProbeProbeCyclingCyclingProbeProbeMolecularMolecularBeaconBeaconetc.荧光染料嵌合法荧光染料嵌合法荧光探针法荧光探针法Real Time PCRReal Time PCR的检测方法的检测方法实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍7 7March 2, 2022March 2, 2022荧光染料嵌合法（荧光染料嵌合法（SYBR Green ISYBR

5、 Green I）SYBR Green ISYBR Green I：是一种能结合于所有：是一种能结合于所有dsDNAdsDNA双螺旋小沟区域的双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。具有绿色激发波长的染料。实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍8 8March 2, 2022March 2, 2022Primer退退 火火 FFFFSYBR Green I 法法作用机理示意图作用机理示意图Pol.FPrimerPol.延延 伸伸 FFFFFFPrimer热变性热变性 FFFF实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍9 9March 2, 2022March 2, 2022TaqManTaqMa

6、n法作用机理法作用机理TaqManTaqMan探针为一寡核苷酸，探针为一寡核苷酸，5 5 端标记一个报告基团（端标记一个报告基团（ReporterReporter），），3 3 端标记一个淬灭基团（端标记一个淬灭基团（QuencherQuencher）。）。 RQ实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1010March 2, 2022March 2, 2022RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.热变性热变性 退退 火火 延延 伸伸 TaqMan ProbeTaqMan Probe法原理示意图法原理示意图 实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1111March 2,

7、 2022March 2, 2022 One-Step RT-PCR特异性高特异性高多重多重PCRPCR检出检出ProbeProbe设计要求高设计要求高 ProbeProbe法法 ProbeProbe合成费用高合成费用高SYBR Green I SYBR Green I 法与法与ProbeProbe法比较法比较常用于常用于mRNAmRNA表达量分析等表达量分析等SYBR Green I SYBR Green I 法法 简便易行简便易行价格便宜价格便宜要求反应的特异性要求反应的特异性不能进行多重不能进行多重PCRPCR常用于常用于SNPSNP解析，病毒、病源菌检测解析，病毒、病源菌检测实时荧光定

8、量实时荧光定量PCR介绍介绍1212March 2, 2022March 2, 2022主主 要要 内内 容容2Real Time PCR实验方法实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1313March 2, 2022March 2, 2022RTRT PrimerPrimer的选择的选择 Random PrimerRandom Primer Oligo dT PrimerOligo dT Primer Gene Specific Primer Gene Specific PrimerRandom 6mer PrimerRandom 6mer PrimerGene Specific Prime

9、rGene Specific PrimerOligo dT PrimerOligo dT PrimerPCR R-PrimerPCR R-PrimerPCR F-PrimerPCR F-Primer实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1414March 2, 2022March 2, 2022目的片段在距目的片段在距Poly(A) Tail Poly(A) Tail 1.5 kbp 1.5 kbp 以内适用，以内适用，RTRT效率效率较高。较高。One Step RT-PCR One Step RT-PCR 只能使只能使用用Gene Specific PrimerGene Specific

10、Primer，但不适用于复数基因的检但不适用于复数基因的检出。出。5 53 3Gene Specific PrimerGene Specific Primer目的片段目的片段R RF FAAAAAA5 53 3目的片段目的片段R RF F1,500 base1,500 baseOligo dT PrimerOligo dT PrimerRandomRandom目的片段目的片段5 53 3R RF F目的片段在目的片段在mRNAmRNA任何位任何位置都能使用。通常置都能使用。通常mRNAmRNA表达量分析最适。表达量分析最适。Oligo dT PrimerOligo dT Primer5 53

11、3R RF FAAAAAA目的片段目的片段RandomRandom适用于适用于mRNAmRNA表达量分析，表达量分析，提升反应检测的灵敏度。提升反应检测的灵敏度。RTRT PrimerPrimer的选择的选择实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1515March 2, 2022March 2, 2022Real Time PCRReal Time PCR引物设计引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求

12、严格。性反应和引物二聚体要求严格。Real Time PCRReal Time PCR用引物与普通用引物与普通PCRPCR引物设计要求不同引物设计要求不同= = 对引物设计要求严格对引物设计要求严格普通普通PCRPCR引物引物Real Time PCRReal Time PCR引物引物实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1616March 2, 2022March 2, 2022两条引物的两条引物的TmTm值尽量接近，应用专用软件计算值尽量接近，应用专用软件计算TmTm值值 TmTm值值40-60%(40-60%(最好最好45-55%)45-55%) GCGC含量含量PrimerPrimer

13、长度长度80-150 bp(80-150 bp(尽量限制在尽量限制在300 bp300 bp以内以内) )扩增片段大小扩增片段大小17-25 base17-25 base使用使用BLASTBLAST检索，确认引物特异性检索，确认引物特异性 特异性特异性 引物内部或两条引物之间避免引物内部或两条引物之间避免3 base3 base以上的互补序列以上的互补序列 引物引物3 3 末端避免末端避免2 base2 base以上的互补序列以上的互补序列 互补性互补性3 3 末端序列末端序列 整体上碱基不能过偏整体上碱基不能过偏 个别部分避免个别部分避免GC richGC rich或或AT rich(AT

14、rich(特别是特别是3 3 端端) ) 避免避免T/CT/C连续，连续，A/GA/G连续连续序列序列 3 3 末端避免末端避免GC richGC rich或或AT richAT rich 3 3 末端碱基最好为末端碱基最好为G G 或或C C 3 3 末端碱基尽量避免为末端碱基尽量避免为T T尽量在尽量在Exon junctionExon junction上设计引物，限制基因组上设计引物，限制基因组DNADNA扩增扩增 RT-PCRRT-PCR用引物用引物Real Time PCRReal Time PCR引物设计原则引物设计原则实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1717March 2,

15、 2022March 2, 2022探针的探针的TmTm比引物高比引物高8-108-10 TmTm值值20-24 bp20-24 bp ProbeProbe长度长度探针探针5 5 末端的第一个碱基不能是末端的第一个碱基不能是G G5 5 末端序列末端序列 目的序列目的序列GCGC含量相对较高的区域设计含量相对较高的区域设计 整体上碱基不能过偏整体上碱基不能过偏 个别部分避免个别部分避免GC richGC rich或或AT rich (AT rich (特别是特别是3 3 端端) )；避免；避免T/C T/C 连续，连续，A/CA/C连续连续序列序列ProbeProbe内部或内部或ProbePr

16、obe与两条引物之间避免与两条引物之间避免3 base3 base以上的互补序列以上的互补序列 互补性互补性BLASTBLAST检索确认检索确认ProbeProbe特异性特异性 特异性特异性Real Time PCRReal Time PCR用用TaqManTaqMan探针设计原则探针设计原则Real Time PCRReal Time PCR探针设计原则探针设计原则实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1818March 2, 2022March 2, 2022线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认检测灵敏度确认PCRPCR扩增效率（扩增效率（E E）：）：0.8-1.2

17、0.8-1.235Cycles35Cycles内可得到好的定量结果。内可得到好的定量结果。如果采用如果采用SYBRSYBR检测方法，检测方法，30Cycles30Cycles内无非特异性产物扩增。内无非特异性产物扩增。No No T Template emplate C Controlontrol确认确认30Cycles30Cycles内无引物二聚体产生。内无引物二聚体产生。相关系数（相关系数（r r2 2）：大于）：大于0.980.98反应性能确认反应性能确认实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1919March 2, 2022March 2, 2022主主 要要 内内 容容3Real T

18、ime PCR解析方法1. 标准曲线分析2. 融解曲线分析3. 绝对定量和相对定量解析方法实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2020March 2, 2022March 2, 2022标准曲线制作标准曲线制作扩增曲线扩增曲线标准曲线标准曲线 标准品梯度的选择：标准品梯度的选择：5 56 6个梯度个梯度 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为标准品稀释倍数通常为101010105 5 10104 4 10103 3 10102 2 10101 1 10100 0 10105 5 10104 4 10 103 3 10 102 2 10 101 1 10 100 0实

19、时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2121March 2, 2022March 2, 2022标准品的种类标准品的种类 基因组基因组DNADNA 质粒质粒 Total RNA & cDNA Total RNA & cDNA 体外转录体外转录RNARNADNADNA样品定量标准品样品定量标准品 RNARNA样品定量标准品样品定量标准品实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2222March 2, 2022March 2, 2022质粒标准品构建流程质粒标准品构建流程基因组基因组DNADNAPCRPCR目的基因克隆目的基因克隆目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因质粒质

20、粒质粒提取，质粒提取，ODOD值定量。将质粒梯度稀释至值定量。将质粒梯度稀释至10105 5-10-101 1 copies/ulcopies/ul，作为标准品。，作为标准品。实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2323March 2, 2022March 2, 2022体外转录体外转录RNARNA标准品构建流程标准品构建流程RNARNA纯化后，测纯化后，测ODOD定量。将定量。将RNARNA梯度稀释至梯度稀释至10105 5-10-101 1 copies/ulcopies/ul，作为标准品。，作为标准品。T7 RNA polymeraseT7 RNA polymerase体外转录体外转录

21、RNARNATotal RNATotal RNAPCRPCRcDNAcDNARTRTT7 PromoterT7 PromoterTTTTTTTTTTPCRPCR产物产物目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2424March 2, 2022March 2, 2022理想的标准品扩增曲线理想的标准品扩增曲线 基线平整基线平整 Negative ControlNegative Control为水平线为水平线 指数区较明显，陡度大指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起平台区汇于一起 线性范围宽线性范围宽实时荧光定量

22、实时荧光定量PCR介绍介绍2525March 2, 2022March 2, 2022理想的标准曲线理想的标准曲线 相关系数（相关系数（r r2 2）：大于）：大于0.980.98，越接近，越接近1 1，结果可信度越高。，结果可信度越高。 扩增效率（扩增效率（E E）：）：0.8-1.20.8-1.2，越接近，越接近1 1，越理想。，越理想。 扩增效率扩增效率 相关系数相关系数 扩增效率（扩增效率（E E）计算方法）计算方法 标准曲线标准曲线X X轴表示起始模板浓度（轴表示起始模板浓度（loglog1010) )，Y Y轴表示轴表示CtCt值时值时 E=10E=10-1/a-1/a-1-1 标

23、准曲线标准曲线X X轴表示轴表示CtCt值，值，Y Y轴表示起始模板浓度（轴表示起始模板浓度（loglog1010) ) E=10 E=10-a-a-1 -1 实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2626March 2, 2022March 2, 2022Real Time PCRReal Time PCR解析方法解析方法3Real Time PCR解析方法1. 1. 标准曲线分析标准曲线分析2. 2. 融解曲线分析融解曲线分析3. 3. 绝对定量和相对定量解析方法绝对定量和相对定量解析方法实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2727March 2, 2022March 2, 2022融解

24、曲线分析融解曲线分析 Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。 SYBR Green I SYBR Green I 法进行检出时，法进行检出时，要根据融解曲线确认要根据融解曲线确认PCRPCR产物的特异性。产物的特异性。实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2828March 2, 2022March 2, 2022特异性产物特异性产物非特异产物非特异产物引物二聚体引物二聚体对对PCRPCR产物特异性进行分析产物特异性进行分析融解曲线分析融解曲线分析实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2929March 2, 2022March 2, 20223Real Time PCR解析方法1. 标准

25、曲线分析2. 融解曲线分析3. 绝对定量和相对定量解析方法Real Time PCR解析方法解析方法实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3030March 2, 2022March 2, 2022绝对定量解析方法绝对定量解析方法提取样品提取样品引物设计引物设计标准品制备标准品制备Real Time PCRReal Time PCR反应反应数据分析数据分析流流程程实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3131March 2, 2022March 2, 2022绝对定量解析方法绝对定量解析方法通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数

26、或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。10105 510104 410103 310101 1扩增曲线图扩增曲线图标准曲线图标准曲线图 检测样品检测样品检测样品检测样品10102 2实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3232March 2, 2022March 2, 2022相对定量解析方法相对定量解析方法以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，进行相对表达量分析。进行相对表达量分析。Sample BSample A目

27、的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同进行相对表达量分析必要性实际上目的基因表达量分析实际上目的基因表达量分析实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3333March 2, 2022March 2, 2022相对定量解析方法相对定量解析方法管家基因管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因, , 如如：GAPDHGAPDH、-actin-actin等。等。筛选方法筛选方法 根据文献提供根据文献提供 通过具体实验筛选通过具体实验筛选实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3434March 2, 2022March 2, 2022主主 要要 内内 容容R

28、eal Time PCR基础知识12Real Time PCR实验方法3Real Time PCR解析方法4Real Time PCR应用实例 对对SARSSARS病毒培养液中所含病毒培养液中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量分析进行定量分析 分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化分析小鼠某目的基因药物处理不同时间点表达量变化实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3535March 2, 2022March 2, 2022绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS培养液中所含培养液中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量 检测方法检测方法 Taq

29、ManTaqMan probe probe 法法 检测样品检测样品 3 3个从个从SARSSARS病毒培养液中提取的病毒培养液中提取的Total RNATotal RNA 目的基因目的基因 SARSSARS病毒病毒RNARNA 内内 参参 SARS Internal ControlSARS Internal Control RNARNA 标标 准准 品品 SARS Control RNASARS Control RNA 试试 剂剂 One Step PrimeScriptOne Step PrimeScript RT-PCR Kit RT-PCR Kit （Perfect Real TimeP

30、erfect Real Time）（）（DRR064DRR064） 仪仪 器器 Smart Cycler Smart Cycler 实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3636March 2, 2022March 2, 2022 SYN247 F02SYN247 F02SYN247R03SYN247R03SYN247 F01SYN247 F01SYN247R02SYN247R02SYN247R01SYN247R01SYN247 F01SYN247 F01BamBamH H HinHind d pBluescript II SK(+pBluescript II SK(+) Vector) Ve

31、ctorT7 PromoterT7 PromoterBamBamH H HinHind d Sac Sac site site SARS Control RNASARS Control RNA构建构建绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS培养液中所含培养液中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3737March 2, 2022March 2, 2022 纯化的纯化的SARS Control RNA ODSARS Control RNA OD值测定结果值测定结果 体外转录的体外转录的SARS Control RNA SARS

32、Control RNA 电泳照片电泳照片M1 M2M1 M2M1: M1: - -HinHind digest d digest M2: DL2,000 MarkerM2: DL2,000 MarkerDNase IDNase I处理前处理前DNase IDNase I处理后处理后绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS培养液中所含培养液中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3838March 2, 2022March 2, 2022 DNADNA BNITMSARAs2 Adaptor R BNITMSARAs2 Adapt

33、or R SacSacsite site Bam Bam Hsite Hsite BNITMSARS1 Adaptor F BNITMSARS1 Adaptor F T7 PromoterT7 PromoterSARS Internal Control RNASARS Internal Control RNA的构建的构建A AA ApBluescriptII pBluescriptII SK(+SK(+) Vector) Vector 绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS培养液中所含培养液中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍

34、介绍3939March 2, 2022March 2, 2022探针的选择探针的选择 TemplateTemplatePrimerPrimerTaqManTaqMan Probe Probe5 5 端报告基团端报告基团3 3 端淬灭基团端淬灭基团SARS Control RNASARS Control RNAor SARS Genomic RNAor SARS Genomic RNA共用共用FAMFAM标记标记EclipseEclipse标记标记SARS Internal Control RNASARS Internal Control RNA共用共用ROXROX标记标记EclipseEcli

35、pse标记标记绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS培养液中所含培养液中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4040March 2, 2022March 2, 2022SARS Control RNA 10SARS Control RNA 105 5-10-101 1扩增曲线扩增曲线 SARS Genomic RNA Sample 1SARS Genomic RNA Sample 1、扩增曲、扩增曲线线 SARS Internal Control RNASARS Internal Control RNA扩增曲线扩增曲线 标准

36、曲线标准曲线 绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS培养液中所含培养液中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4141March 2, 2022March 2, 2022定量结果定量结果对三个样品所含对三个样品所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行了准确定量。进行了准确定量。绝对定量应用例绝对定量应用例 对对SARSSARS培养液中所含培养液中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA进行定量进行定量实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4242March 2, 2022March 2, 2022相对定量应用例相对定量应用

37、例 分析小鼠不同组织中分析小鼠不同组织中PAHPAH基因表达量的变化情况基因表达量的变化情况 检测方法检测方法 SYBR Green I SYBR Green I 荧光嵌合法荧光嵌合法 管家基因管家基因 GAPDHGAPDH基因基因 目的基因目的基因 PAHPAH基因基因 标标 准准 品品 cDNAcDNA 试试 剂剂 PrimeScript RT PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser reagent Kit with gDNA Eraser （DRR047DRR047） SYBRSYBR Premix Ex TaqPremix Ex TaqT

38、MTM II (Tli RNase H Plus) II (Tli RNase H Plus) （DRR820DRR820）仪仪 器器 Thermal Cycler DiceThermal Cycler Dice Real Time System Real Time System （TP800TP800） 实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4343March 2, 2022March 2, 2022Total RNATotal RNA提取提取Total RNATotal RNA基因组基因组DNADNA去除去除标准品标准品RNARNA制备制备标准曲线制作及预实验标准曲线制作及预实验详细的实验

39、资料获取详细的实验资料获取实验设计及引物实验设计及引物 设计、合成设计、合成样品样品Real Time PCRReal Time PCR反应反应相对定量计算及相对定量计算及数据分析数据分析数据整理及论文撰写数据整理及论文撰写相对定量应用例相对定量应用例 分析小鼠不同组织中分析小鼠不同组织中PAHPAH基因表达量的变化情况基因表达量的变化情况实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4444March 2, 2022March 2, 2022提取提取Total RNATotal RNA后电泳照片后电泳照片提取试剂：提取试剂：TaKaRa RNAiso PlusTaKaRa RNAiso Plus （

40、 D9108 D9108 ）相对定量应用例相对定量应用例 分析小鼠不同组织中分析小鼠不同组织中PAHPAH基因表达量的变化情况基因表达量的变化情况M C L B M MM：DL2,000 DNA MarkerDL2,000 DNA MarkerC C：Control RNAControl RNAL L：Liver RNALiver RNAB B：Brain RNABrain RNA实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4545March 2, 2022March 2, 2022目的基因标准曲线制作结果目的基因标准曲线制作结果扩增曲线图扩增曲线图融解曲线图融解曲线图标准曲线图标准曲线图管家基因标准曲线制作结果管家基因标准曲线制作结果相对定量应用例相对定量应用例 分析小鼠不同组织中分析小鼠不同组织中PAHPAH基因表达量的变化情况基因表达量的变化情况实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4646March 2, 2022March 2,