昆虫抗菌肽的研究进展

1、论文题目：昆虫抗菌肽的研究进展摘 要：昆虫抗菌肽是一类具有免疫效应的小分子多肽，它具有热稳定、抗菌谱广、无免疫原性、作用机制独特等特性，是昆虫能够抵御自然界中有害微生物侵染的重要因素。近年来，随着有关抗菌肽作用机理及功能研究的深入，其在医药领域的研究越来越引起人们的关注。本文就昆虫抗菌肽的分类、生物功能、基因工程研究进展以及在医药领域的应用等作一综述。关键词：昆虫；抗菌肽；基因研究；ITitle：Research progress of insect antimicrobial peptidesAbstract: Insect antimicrobial peptides are a clas

2、s of immune response of the small molecule peptide, it has a heat-stable, broad spectrum anti-bacterial, non-immunogenic, and other unique characteristics of the mechanism is able to absorb the nature of insects harmful to an important factor in microbial infection. In recent years, with the role of

3、 the mechanism and function of antimicrobial peptides in-depth study, and its research in the field of medicine a growing cause for concern. In this paper, the classification of insect antimicrobial peptides, biological functions, genetic engineering research as well as the application of the field

4、of medicine are reviewed.Keywords: Insects; Cecropin; gene research;II目 录摘 要 . I Abstract . II绪论 . 11 抗菌肽研究的历史 . 12 抗菌肽的结构和性质 . 12.1含有2螺旋结构的线性抗菌肽 . 12.2含有23 个二硫键的2折叠抗菌肽 . 12.3富含12 种氨基酸残基的抗菌肽 . 22.4具有环状结构的抗菌肽 . 23昆虫抗菌肽的分类 . 24抗菌肽的作用机制 . 24. 1胞膜攻击作用 . 24. 2诱导细胞凋亡 . 24. 3抗菌肽的抑制细胞呼吸作用学说 . 34. 4抑制细胞外膜蛋白的

5、合成 . 34. 5 抑制细胞壁的形成 . 35昆虫抗菌肽的基因工程 . 36昆虫抗菌肽在医药中的应用前景 . 47展望 . 4参考文献 . 6 致 谢 . 错误！未定义书签。IIIIV绪论昆虫是自然界中最大的一个生物类群,几乎所有的生态环境中都分布有各种各样的昆虫。昆虫之所以能够在千变万化的自然界中占据极大的生存优势,是因为他们具有独特而有效的无细胞免疫系统。当昆虫细胞被感染后,其体内能够快速产生一种免疫诱导分子抗菌肽( antimicrobial pep tides) ,它具有分子量小,无免疫原性、热稳定性强、广谱杀菌等特性,是昆虫能够抵御自然界中许多有害微生物侵染的重要因素。家蝇生活在杂

6、菌横生的环境中,自身却不会被这些病原所感染,这一现象说明蝇类具有高度的适应能力和有效的防御机制。正是昆虫本身的这些生物特性引起了科学家的兴趣。1 抗菌肽研究的历史1972年瑞典斯德哥尔摩大学的Boman H. G. 领导的研究小组,用大肠杆菌注射惜古比天蚕蛹,从人工诱导的天蚕免疫血淋巴中发现了抗菌物质,并提纯得到了抗菌肽P9A和P9B,还对它们进行了氨基酸序列测序分析, 确定了抗菌肽的一级结构, 命名为天蚕素( cecrop ins) 。迄今为止,在鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目、等翅目、膜翅目和蜻蜓目等8个目的昆虫中发现超过200多种昆虫抗菌肽类物质。2 抗菌肽的结构和性质抗菌肽在自然界中分

7、布广泛,种类繁多,但根据其结构特征主要可分为4 大类:2.1含有2螺旋结构的线性抗菌肽主要包括Cecropins 和Magainins 家族,具有很强的抗菌活性,但对哺乳动物细胞无毒副作用。这些抗菌肽只有在两亲性环境下才具有稳定的2螺旋结构,这种2螺旋结构是抗菌肽在抗微生物时所必需的,特别对于膜结合抗菌肽尤其需要稳定的螺旋结构。研究发现,序列同源性并非抗菌肽生物活性所必需的条件,但两亲螺旋结构域是它们一致的结构特征,具有2螺旋结构的抗菌肽在分子中间部位有一柔性弯曲部分,这一弯曲部分在抗菌肽的细胞选择性中至关重要,可以有效抑制细胞的溶血活性。2.2含有23 个二硫键的2折叠抗菌肽这类抗菌肽很多,

8、主要有Defensins (防御素) 、Prote2grins 和Tachyplesins 家族抗菌肽。它们的分子结构中均含有23 个二硫键,以稳定其2折叠结构。最具特征的2折叠抗菌肽是从日本马蹄蟹中分离出来的Tachyplesins ,它包含1718 个氨基酸残基,其中的Tachyplesin 1 是一个由2转角(包含811 氨基酸残基) 连接两段反平行2折叠链(分别包含38 和1116 个氨基酸残基) 的多肽,其抗菌机理还不十分清楚,但它对脂多糖(L PS) 具有高度的亲和性,因此可能存在一个胞内的靶目标2 。DNase I 足迹实验和DMS 实验证明,它可以与DNA 的小沟结合2 ,7

9、。第 1 页 共 7 页2.3富含12 种氨基酸残基的抗菌肽在蜜蜂中发现的Apidaecin 抗菌肽包含18 个氨基酸残基,其中富含Pro 和Arg ,主要抗革兰氏阴性菌。PR239 、Bac7 和Bac5 等均属于Pro2Arg 家族。另外,来源于牛中性粒细胞的Indolicidin ,富含Trp 和Pro ,其C2端酰胺化,呈两亲性转角结构,具有中度抗菌活性,但与L PS 亲和性低,其作用机理尚不清楚。通过对该抗菌肽类似物的研究后发现,增加分子的正电荷数或增强疏水性都不能改变其膜迁移能力8 ,9 。但经1 H NMR 结果分析显示,当用Ala 替换其中的Pro 残基后,其二级结构由伸展状转

10、变成为螺旋3 状,导致其膜插入程度的增加和跨膜迁移的提高,从而使得它更好地进入细胞质及胞质靶位点9 。2.4具有环状结构的抗菌肽这类抗菌肽主要包括从牛嗜中性粒细胞中分离得到的环状12 肽Bactenecin 和在蛙类Rana 中发现的Brevinins ,Esculentin 和Ranalexino 。具有抗革兰阴性、阳性菌及真菌的活性,其活性可以和2折叠肽家族成员相比。然而其抗菌机理仍有待于进一步的研究。3昆虫抗菌肽的分类昆虫抗菌肽分为4类: (1)以天蚕素为代表的不含半胱氨酸残基的抗菌肽,现在已经从鳞翅目的蛾类、蝴蝶及双翅目的蝇类中分离纯化出20多种天蚕素类似物。(2)以防御素、死亡素为代

11、表的富含半胱氨酸残基的碱性多肽。(3)以膜翅目昆虫中发现的蜜蜂肽等为代表的富含脯氨酸残基的抗菌肽。(4)以双翅目昆虫中分离得到的双翅肽、攻击素、麻蝇毒素等为代表的富含甘氨酸残基的抗菌肽。4抗菌肽的作用机制4. 1胞膜攻击作用大多数抗菌肽最基本的作用机制是破坏肿瘤或细菌质膜结构,引起胞内水溶性物质大量渗出,从而最终导致肿瘤细胞和细菌的死亡,而抗菌肽分子的结构特征是保证上述机制发挥作用的重要基础。昆虫天蚕素抗菌肽分子是通过其螺旋上正电荷与细菌细胞膜磷脂分子上负电荷之间的静电吸引而结合聚集在质膜上,而疏水端C端(酰胺基)插入到疏水的细菌细胞膜中央,螺旋留在质膜表面,打乱了质膜上蛋白质和脂质原来的排列

12、顺序,使得膜外正电荷增多,超过阈值时导致膜去极化。由于抗菌肽分子的螺旋是亲水、疏水两亲性的,所以当抗菌肽分子相互聚集在一起时,可形成离子通道,导致阳离子外流,最后细菌失去保护,不能保持正常的渗透压而死亡。4. 2诱导细胞凋亡Mai等以融合抗菌肽DP1 局部注射到小鼠实体瘤内, 并研究DP1 对肿瘤细胞株MCA20凋亡的影响,结果发现DP1 可迅速诱导凋亡,并使肿瘤体积缩小。Chen等以抗菌肽RGDtachypesin作用于前列腺癌细胞株TSU,以荧光免疫法和Western印迹杂交法检测,第 2 页 共 7 页结果发现凋亡相关蛋白caspase9、caspase8 、caspase3以及Fas配

13、体表达均升高,提示抗菌肽可以诱导与Fas相关的凋亡,因此推测诱导凋亡可能是某些抗菌肽的作用机制之一。4. 3抗菌肽的抑制细胞呼吸作用学说Fehlbaum等(1996年)研究发现,当昆虫死亡素的浓度在0. 3 0.6mol /L时,对大肠杆菌就表现出强烈的杀菌作用,但当其浓度提高到70mol /L时,仍然检测不到细胞内钾离子的泄漏,这表明死亡素不是通过改变细胞膜通透性来杀菌的,而当40mol /L的死亡素处理细菌lh后,可检测到细胞的呼吸作用变弱, 6h后呼吸作用完全停止,据此推断死亡素是通过抑制细胞呼吸作用来杀菌。4. 4抑制细胞外膜蛋白的合成Carsson等(1991年)研究发现,攻击素能够

14、干扰大肠杆菌细胞外膜蛋白Omp C、Omp F、Omp A和LamB基因的转录,使这些蛋白质含量减少,从而导致细胞膜的通透性增加,细菌的生长受到抑制。4. 5 抑制细胞壁的形成Ando等( 1988 年)研究认为,麻蝇毒素能够抑制细菌细胞壁的形成,使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻,但对已经形成的细胞壁无作用。除此之外,有科学家认为含脯氨酸的抗菌肽与细菌的热休克蛋白结合,从而发挥抗菌作用;还有研究表明抗菌肽是通过多种因素的协同作用来完成杀菌功能的;抗菌肽还可通过促进机体的免疫功能来提高抗菌能力。有意义的是,昆虫抗菌肽只对原核生物细胞和发生病变的真核细胞有杀伤作用。而对正常真核生物细胞却没有

15、作用。原因可能在于原核生物与真核生物细胞的膜结构不同,后者细胞膜中含有大量的胆固醇,而胆固醇的存在使细胞膜结构稳定,阻止抗菌肽的疏水端插入胞膜的磷脂双分子层。而且,高等动物细胞存在高度发达的细胞骨架系统,它的存在抵抗了抗菌肽的作用。另外还可能是高等动物细胞膜外表面的唾液酸与膜的距离有8nm,它可能与抗菌肽的带正电荷区结合而阻止其接近细胞膜发挥杀伤作用。5昆虫抗菌肽的基因工程在鳞翅目、膜翅目以及包括果蝇在内的双翅目昆虫中,编码抗菌肽(如天蚕素、防御素等)的基因已经被成功克隆。研究发现,这些基因属于典型的真核基因,具有一个CAAT和一个TATA框,转录产物具有一个特异的帽子位点和多聚腺苷酸加尾信号

16、序列(AATAA) ,并且具有内含子和假基因,各种抗菌肽在翻译后首先是以前体形式存在的,其前体肽包含一个信号肽序列、肽前体序列和成熟肽前体,经过蛋白酶水解后产生成熟肽。不同的抗菌肽都存在保守和可变序列,最近从伊蚊中分离得到的一个新天蚕素,通过序列比对分析发现,它与果蝇体内分离的抗菌肽的同源性为37%。而对防御素的研究发现,它们一般都存在6个保守的半胱氨酸序列,从不同昆虫体内得到的防御素彼此的相似性很高(均在90%左右) ,其中家蝇与麻蝇防御性氨基酸序列的同源性高达到94% 5 。昆虫抗菌肽在植物基因工程中成绩喜人: Desten2rano - Beltan构建了shiva - 1和天蚕素B 基

17、因第 3 页 共 7 页的植物表达载体,并将shiva - 1 和天蚕素B 基因转入烟草和马铃薯,结果转shiva - 1基因的烟草青枯病发病延迟,病情指数低下,植株死亡率降低,但天蚕素B转基因烟草则未观察到青枯病的抗性有所增加,原因可能是天蚕素B被蛋白酶水解。2000年, Sharma等将天蚕素B基因转入水稻,利用稻谷壳质酶信号肽使天蚕素B分泌到细胞间隙,从而保护了目的肽免受细胞中肽酶的降解,获得了抗病能力增强的水稻品系。人们在菊花、毛白杨、番茄等农作物中也进行了抗菌肽转基因工作,并取得了很大的进展。抗菌肽转基因植物的研究为将来获得抗病植株提供了广阔的前景。昆虫抗菌肽转基因动物研究方面主要集

18、中在提高动物的抗病能力和传染病防治。Reed等将shiva - 1a基因转入小鼠中,结果转基因鼠对布鲁氏杆菌抵抗明显增加。昆虫是很多人类疾病的传播媒介,通过转基因构建一个新品系来中断传播途径是克服人类传染病的一条新思路。6昆虫抗菌肽在医药中的应用前景 抗生素的发现曾经为人类抗御疾病提供了有效手段。但是，随着抗生素的滥用，病原微生物也在变异和进化中不断捕获耐药能力，以致近些年不断有“超级细菌”的新闻见诸报道。作为新一代天然抗生素，抗菌肽的作用机理不同于传统抗生素，它通过电荷中和的机制穿透细菌膜性结构杀死细菌，即它作用于靶“结构”而非“功能”，因此，极大地减少了靶菌株产生抗药性的可能性；此外，尽管

19、昆虫抗菌肽的有效活性浓度与传统的抗生素相比相对较低，但是由于它具有抗菌谱广、种类多、对许多致病菌都具有明显有效的抗菌作用，以及无致畸性、无蓄积毒性等特点，均使其作为现有抗生素可能的有效替代品而备受人类的青睐。目前，对抗菌肽的研发工作已经发展到疾病防治的各个领域，一些抗菌肽已进入临床试验。美国马盖宁制药公司已筛选出一种源于蛙皮素magainin的小肽MSI-78，在期临床试验的926例糖尿病患者中，其对多种病原菌感染引起的足溃疡均有显著疗效；在脑脊髓膜炎、人幽门螺旋杆菌感染及抗真菌感染等领域抗菌肽已经进入了临床前期应用阶段27；德国学者已将从果蝇体内提取的抗菌肽用于化疗和器官移植后出现的重度真菌

20、感染等治疗。在我国，一些抗菌肽作为临床新药已经获得了初步成功，如用于治疗肾炎的“肾肝宁”及批准作为类西药进行临床观察的乙型肝炎新药；而以抗菌肽作为消洗剂、治疗胃十二指肠溃疡及消化道炎症等新药的临床实验也正在进行中28。抗菌肽在新药开发中越来越表现出巨大的应用潜力,并成为研究热点，随着新型抗菌肽的不断发现以及基因工程改造抗菌肽的日趋完善，抗菌肽极有可能作为一种安全有效的新型药物广泛应用于医学临床领域。7展望20世纪90年代后期以来，随着分子生物学技术在生物学和医学领域的广泛应用，某些昆虫抗菌肽的基因或cDNA片段已经被陆续克隆和分离出来，使得人们对抗菌肽的性质和特征有了进一步的了解29。研究发现

21、，不同种类的昆虫所产生的抗菌肽不尽相同，而且，在对昆虫免疫反应进行研究的过程中，往往涉及到某些新基因的寻找和鉴定。因此，从不同的昆虫体内寻找其独特的新型抗菌肽，正逐渐成为学者们热衷的研究目标。第 4 页 共 7 页家蝇生活在杂菌横生的环境中，自身却不会被这些病原所感染，这一现象说明蝇类具有高度的适应能力和有效的防御机制。正是由于家蝇特殊的免疫防御机制，才使其能够长期稳定维持自身的生存而免遭细菌、真菌、病毒和寄生虫的侵染。在我国，很早以前就有应用家蝇（蝇蛆疗法）进行中医治疗的记载，将家蝇幼虫洗净晒干后与其他中药配伍制成外用中药药剂，能有效治疗创伤和溃烂等感染性疾病。研究发现，一种昆虫每遭受一次侵

22、染可以同时产生1015种抗菌肽，例如果蝇就可以同时产生7种无同源性的并且拥有完全不同抗菌谱的抗菌肽。由此可以预测，家蝇体内也极有可能存在一定数量的抗菌肽基因。但是，由于目前对家蝇抗菌肽基因的捕获几乎都是基于同源克隆的策略，使得已克隆得到的昆虫抗菌肽基因数量显得相对有限，尚有大量无同源性的抗菌肽基因有待发现和克隆。本文作者正试图以家蝇幼虫为材料，通过不同的诱导方法产生具有不同抗菌谱的抗菌肽，借鉴2006年3月最新发表的杂交监控差异分析法HMDA法30，依托内源性保守基因监控的杂交体系，构建诱导后高表达的抗菌肽差减cDNA文库，进而扩增家蝇抗菌肽全长基因。探索家蝇幼虫抗菌肽新基因，将为家蝇幼虫抗菌肽的基因工程生产奠定坚实的基础，为抗菌肽的分子生物学和杀菌机理的研究提供有力依据，同时也为寻找其活性位点，实现在酵母或细菌中高效表达，并为开发具有自主知识产权的新型抗细菌、真菌、病毒的人用医药生物制剂提供前期的知识产权和相关技术储备。第 5 页 共 7 页参考