鱼油中EPA和DHA的富集方法及研究进展

1、中图分类号:TS22;文献标识码:A;文章篇号:1007-2764(200601-0160-062鱼油中EPA和DHA的富集方法及研究进展曾远平,刘耘,杨继国(华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州 510640摘要:-3类型脂肪酸浓缩型产品的生产方法一直是制药业和健康食品业的一个重要的研究课题。随着人们对海产食品及其-3多不饱和脂肪酸营养价值认识的加深,此类产品未来将拥有巨大的市场发展潜力。本文主要阐述了近年来-3多不饱和脂肪酸富集方法及其研究进展。关键词:EPA;DHA;脂肪酶;鱼油;-3多不饱和脂肪酸Development of Concentration Study of EPA a

2、nd DHA in Fish OilZeng Yuan-ping, Liu Yun, Y ang Ji-guo(College of Bioscience and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China Abstract: Concentration of production of omega-3 (-3 fatty acid continues to be a topic of interest for both the pharmaceutical and health food

3、 industries. With the growing public awareness of the nutritional benefits of seafood and their -3 PUFA, the market for such products is expected to grow in the future. This overview provides a discussion of methodologies developed for producing -3 PUFA concentrates from source materials.Keywords:EP

4、A; DHA; Lipase; Fish oil; -3 PUFA人们很早就发现脂质,特别是多不饱和脂肪酸(PUFA对正常的生长和营养是必需的。鱼油中富含的长链-3多不饱和脂肪酸,通常以甘油三酯(TG和磷脂(PL的形式存在,其中最主要的两种-3 PUFA分别是二十碳五烯酸(EPA和二十二碳六烯酸(DHA。1978年,Dyerberg博士 1通过实验证明鱼油中的这两种多不饱和脂肪酸,可有效防治心血管病。时至今日,鱼油制品已成为最重要的保健品之一。从天然海产鱼制得的多不饱和脂肪酸中,EPA和DHA的含量随鱼的种类而不同,通常在5%15%之间,而-3 PUFA的总含量则常在15%25%之间,这样低的

5、含量并不能满足现代保健品的要求,故近年来,制药及保健食品行业纷纷根据长链-3 PUFA的物理和化学性质对其进行提纯富集。一般-3 PUFA的分离和精制的方法主要可分为传统理化方法和酶法两大类。1 传统理化方法从鱼油提纯富集EPA和DHA的传统理化方法有低温结晶法、金属盐沉淀法、尿素包合法、超临界萃取法、分子蒸馏法以及高效液相层析法等。1.1 低温结晶法2收稿日期:2005-9-14作者简介: 曾远平,硕士,现主要从事油脂改性和脂肪酶应用的研究 一般来说,两种不同脂肪酸双键数差别越大,其在有机溶剂中的溶解度差别就越大。而且这种差异在低温下更加明显。因此,可将各种脂肪酸的混合物溶于适当的有机溶剂,

6、先进行低温冷藏,过滤除去大量饱和脂肪酸以及低不饱和脂肪酸后蒸去有机溶剂,即可得到EPA和DHA的浓缩产物。此低温结晶法具有设备简单,操作方便安全,有效成分不易变性的优点,但该法需使用大量有机溶剂,而且溶剂有残留,产率较低,不适合大规模生产。李和等3采用低温结晶法,选用丙醇:乙醇(9 : 1, V/V混合溶剂,经一次结晶分离,EPA和DHA含量由7%15%提高到50%58%,经两次结晶分离可达到73%79%。1.2 金属盐沉淀法2金属盐沉淀法是利用饱和脂肪酸金属盐在有机溶剂中的溶解度小的特点来进行分离,多采用钠盐或者锂盐丙酮法。此法操作简单,大多工序是在常温下完成,无需使用大量的有机溶剂,选择性

7、强,成本较低,是分离鱼油多不饱和脂肪酸的一个比较常用的方法。但金属盐离子的回收比较麻烦,对环境的污染较大,这是该方法的一大不足。郑公铭等4采用金属盐沉淀和尿素包合法相结合的方法来富集鱼油中的EPA和DHA,使所得产品中160EPA和DHA的总含量达到了82.57%。1.3 尿素包合法(脲包法 2、5饱和或低不饱和脂肪酸或酯容易被尿素包合,而多不饱和脂肪酸或酯不易被尿素包合。EPA和DHA分别含有5个及6个双键,由于空间位阻,很难与尿素形成稳定的包合物,而鱼油中饱和及低不饱和脂肪酸或酯能借助范德华引力、色散力或静电力与尿素形成稳定的包合物并在低温下结晶析出,而EPA和DHA仍留在滤液中,从而达到

8、分离富集的目的。曾有日本学者使用尿素包合法制得过较纯的EPA和DHA乙酯。朱世云等6 使用尿素包合法对大连鱼油中的EPA和DHA进行富集,以鱼油甲酯为脲包客体,以甲醇作溶剂,在脲酯比为13:1的条件下进行富集,一次富集产品中EPA + DHA的浓度和收率分别达到60%和90%以上。文震等7通过多烯脂肪酸尿素包合技术处理鱼油,在酯脲比为115的条件下,脲包一次富集后,鱼油中EPA和DHA含量提至67.32%。增加尿素的用量,可使EPA和DHA的含量超过70%。Gamez-Meza等人8利用联合了尿素络合的酶的水解或者化学水解的方法来获得高纯度的沙丁鱼鱼油-3 PUFA。他们先通过化学或酶解的方法

9、得到的沙丁鱼鱼油中的二十碳五烯酸(EPA和二十二碳六烯酸(DHA,然后通过尿素包埋的方法进行浓缩,得到EPA和DHA的浓度可达到46.2%和40.3%。1.4 超临界萃取法9超临界萃取作为一种对环境友好的新兴分离技术在近20年来得到了很大发展。用经过高度压缩的超临界气体作为溶媒进行萃取,形成超临界负载相,然后降低载气的压力或提高载气的温度,使其溶解能力降低,萃取物就沉淀出来与载气分离。目前多以超临界CO2作为溶剂。以CO2为溶剂萃取分离不同油脂或脂肪酸的研究越来越受到人们的青睐。添加适当的夹带剂可以提高溶剂携带溶质的能力,同时可以降低操作压力,减少设备投资和操作费用,但如何通过夹带剂改善CO2

10、对不同脂肪酸(酯的选择性尚需进一步的研究 10。吴光红等11通过自行设计的单釜超亚临界CO2萃取装置来富集鱼油中的EPA和DHA,得到EPA和DHA的产量接近60%。刘伟民等12通过在内回流的填料塔中用超临界CO2分离鱼油EPA和DHA,在塔底得到的EPA + DHA 的浓度为83%,回收率达到84%,综合指标为1.65。Kim13用带热端回流和温度梯度精馏柱的萃取装置分离鱼油乙酯混合物,获得的EPA和DHA产品纯度分别为60%和67%。Kim估计若重复提纯34次,可以获得90%以上的EPA和DHA产品。吕晴14利用超临界CO2萃取精馏工艺富集提纯经尿素包合预处理后的鱼油乙酯,结合温度梯度和程

11、序升压的方法,使鱼油脂肪酸乙酯按碳链长度依次分离。这种将尿素包合预浓缩与超临界CO2萃取精馏相结合的工艺,可使原鱼油中的EPA含量从原来的12.11%最终提高到67.10%,DHA含量从原来的17.93%最终提高到90.31% 。1.5 分子蒸馏法不同碳链长度和饱和程度的脂肪酸在特定的真空条件下具有不同的沸点15 ,利用对分子蒸馏温度和压力及流量的控制调节,进行多级分子蒸馏,可以得到含有不同EPA和DHA配比的产品,以满足不同人群的使用要求。分子蒸馏技术制备鱼油中的多不饱和脂肪酸,具有提取率高、环境污染小、易于工业化连续生产的特点,发展前景良好。但由于分子蒸馏法需要在高真空度、较高温度下进行,

12、易引起PUFA的降解,这在一定程度上限制了该技术在鱼油富集中的应用。傅红等16采用多级分子蒸馏技术,当蒸馏温度为110 以上,蒸馏压力为20 Pa以下时,经过三级串联分子蒸馏,得到多不饱和脂肪酸质量分数为90.96%的鱼油产品1.6 高效液相色谱法17利用EPA和DHA与饱和脂肪酸、低不饱和脂肪酸的极性差异,可使用高效液相色谱法来进行分离。常用的色谱柱有PAK-500/C18柱,Permaphace ODS 柱等,常用乙醇、四氢呋喃等为洗脱液。在日本已有人用大型的制备柱来进行生产高纯的EPA和DHA。尽管用液相色谱法能在一定程度上富集长碳链-3PUFA,并将其浓缩到一定的程度,而且层析载体具有

13、耐久性,柱可反复利用等优势,但需使用大量的溶剂且生产能力低,产品过氧化值过高,而且所使用的四氢呋喃、乙腈等均为有毒的有机溶剂,因此,该方法不适合鱼油浓缩型保健食品的生产。1.7 银离子络合法银离子与含有烯键的化合物发生反应,生成以烯键化合物为配位的络合物18。利用Ag(EPA络合物和Ag(DHA络合物的稳定性不同,水洗后使用有机溶剂进行萃取,可分离出含DHA量很高的产品以及EPA含量高于DHA的产品。陶遵威等19采用硝酸银-水法分离提纯鱼油中的EPA和 DHA,最终EPA和DHA的产量可达到95%161以上。2 酶法近年来,利用微生物酶富集-3PUFA的方法逐渐受到人们的重视。与物理和化学方法

14、相比,酶法有一系列的优点,首先,酶催化效率高,在大规模的生产中用量很少,且固定化酶能多次的重复利用;再则,酶催化反应在温和的pH、温度和压力下进行,这对不稳定的长链-3PUFA来说尤为重要。在通常的理化反应条件下长链-3PUFA中顺式结构双键被氧化、顺反异构、双键的移位和聚合反应都易发生;最后,酶催化反应能降低能量的消耗,这在能源短缺的时代是非常必要的。进一步说,由于酶催化反应能在无溶剂条件下进行,可以避免庞大的设备和繁杂的工艺流程,而操作人员也能在安全的条件下工作。2.1 酶促水解法正常情况下,在鱼油里面甘油的中间位置会聚集到更多的-3类型多不饱和脂肪酸,所以1,3位点脂肪酶被用于鱼油的选择

15、性水解反应中。选择性水解从鱼油中浓缩-3PUFA是最为简单的一种方法,但富集的效率并不是很高,因此,进一步探索脂肪酶催化或结合其它方便可行的新方法是人们追求的目标。石红旗等20用国产解脂假丝酵母脂肪酶对鱼油进行选择性水解实验,产品中DHA和EPA 含量分别为34.0%和13.9% , 总含量为47.9%。吴可克等21研究了假丝酵母脂肪酶催化鱼油选择性水解反应。他们把水解率控制在53%左右,经低温脱酸分离,制得EPA 和DHA含量大于50%的鱼油甘油酯型产品。王运吉等22报导了一种新的固定化方法。他们以聚氨酯泡沫为载体,采用固态培养方法固定化Rhizopus chinensis WZH-8细胞。

16、在最佳条件下,固定胞内脂肪酶与非固定化的自由菌丝胞内脂肪酶相比,前者水解活力提高了25%以上,pH和热稳定性也显著提高。酶法选择性水解鱼油,-3PUFA 由27%提高到53%以上。2.2 酶促酸解法根据前人的研究,在反应中长链-3PUFA的反应效率要高于长链-3PUFA的酯。因此有科学家建议将酶催化水解反应与酸解反应相结合,以增加甘油三酯中PUFA的含量。虽然脂肪酶催化鱼油中的短、中碳链的脂肪酸的酸解反应并不能使甘油三酯中长链-3PUFA的含量增加,但人体对长链-3PUFA的吸收率因其甘油三酯的形式存在而得以提高。在酸解反应中水的量是一个影响反应的重要参数。水量太高,则酸解反应平衡被破坏而转变

17、为水解反应,水量过少,又将会影响脂肪酶的活性。由于脂肪酶的催化水解作用,在同样的反应条件下,长链-3PUFA与甘油酯结合的效率远低于短链和中链脂肪酸。这也是酸解法富集长链-3PUFA所存在的问题与不足。Akimoto等人23使用Lipozyme IM酶催化豆油和从沙丁鱼油中富集到的-3多不饱和脂肪酸的酯化反应,使用庚烷作为有机溶剂,72小时后油脂中-3多不饱和脂肪酸的比例可以达到34.1%。Fajardo等人24通过研究使用lipase IM60催化棕榈油和-3多不饱和脂肪酸的反应,使用正己烷作为有机溶剂,24小时后反应产物含20.8%的EPA和15.6%的DHA。2.3 酶促醇解法虽然酸解能

18、增加油中长链-3PUFA的量,但它需要反应体系中有大量的长链-3PUFA作为酰基的原料,而且长链-3PUFA必须通过一种方便的方法制得。因此,人们对另一种得到高含量长链-3PUFA的方法进行探讨。在醇解反应中水的含量和脂肪醇的种类是影响醇解效率的两个关键因素。.有科学家筛选了10种醇解反应所使用的醇,发现异丙醇和乙醇是最佳选择。但仍有许多研究者认为月桂醇最为适合。沈继红25等做了这方面的尝试,他们将适量鱼油预热至80,加入一定量的氢氧化钠的乙醇溶液,搅拌回流2h ,终止反应,用大量热水洗去皂脚和其它可溶物,脱水得到乙酯化产品。他们得到的结论是,原料鱼油在低酸值、低过氧化值、低水分时对乙酯化反应

19、是有利的,采用此方法,乙酯化鱼油的得率可以达到84.3%。傅红等26也研究了鱼油甘油三酯和无水乙醇在NaOH作为碱性催化剂的条件下的反应,反应的最适工艺条件为:无水乙醇/鱼油甘油三酯=6:1(摩尔比,反应温度为7577,反应时间2小时,碱催化剂浓度为0.8N-1.0N,由分子蒸馏得到乙酯化得率为96%。2.4 酶促酯化合成法要通过前面介绍的各种酶法得到纯粹的长链-3PUFA甘油三酯是非常困难的,因此,人们提出了用酶法合成长链-3PUFA甘油三酯。他们强调了反应中有机溶剂的重要性,认为有机溶剂为反应提供了一个均匀的体系。合成反应中水的用量也是一个重要的因素,它影响着反应的平衡和酶的活性。Medi

20、na等27用加拿大假丝酵母脂肪酶 Novozym 435催化多不饱和脂肪酸(PUFA和甘油合成甘油三酯的酯化反应。他们确定的最佳的反应条件是:100 毫克脂肪酶; 9 毫升正己烷; 反应温度为50;甘油与162PUFA 的摩尔比为1.2:3;开始含水量0%;反应开始后添加1克分子筛;搅拌转速为200 rpm。在这样的条件下,在鳕鱼肝油多不饱和脂肪酸浓缩反应中,甘油三酯的产率可以达到93.5%;得到的产品里含有25.7%的二十碳五烯酸(EPA和44.7%的二十二碳六烯酸(DHA。3 展望与发达国家相比,我国有关EPA和DHA的研究以及脂肪酶在鱼油处理的应用工作开展的较晚,在这方面的研究应立足于活

21、性更高的酶制剂、酶的固定化方法和新型生物反应器,另外从鱼油中分离出高纯度的EPA和DHA等物质,还有待于做进一步的工作。就目前的研究情况来看,把鱼油添加到食品中最好的方法可能是利用高质量精炼油以微胶囊化形式添加,提高微胶囊化技术,以达到能制取高精度细粉的程度,且不影响任何添加食品的口感、风味或货架寿命28。在未来的年代里,它可能成为一种正规的实施方法。人们将以之制备高质量油并且该项技术正处于迅速发展之中。对鱼油的认识尤其在近几年来逐渐深入,随着技术难题的攻关,产品质量明显提高。尽管鱼油保健品在生产与推广消费各环节仍存在许多尚未完全解决的问题,但随着人民生活水平的日渐提高,卫生保健意识的日趋增强

22、,鱼油保健品开发前景仍然可观。参考文献1 Dyerberg J,Bang H O, Sotoffersen E,et al. Eicosapentaenoicacid and prevention of thrombosis and atherosderosis. L ancet,1978, 2(8081 : 117119.2 雷启骏.中国海洋药物,1993,12(4: 183 李和,李佩文,杨亦平,等.低温结晶富集鱼油中EPA和DHA的方法.中国海洋药物,1997,4: 50524 郑公铭,齐凯琴,李德豪,等.皂化-尿素包合法制备高含量EPA、DHA产品研究.中国油脂,2001,06: 61

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