高胆固醇血症对健康大鼠肾脏形态学的影响

1、    高胆固醇血症对健康大鼠肾脏形态学的影响        摘要目的：探讨高胆固醇血症对健康大鼠肾脏形态学的影响。方法：用5高胆固醇饲料喂养健康雄性Wistar大鼠，分别于实验第30、60和90天进行肾脏的形态学观察。结果：自实验第30天起，高胆固醇组表现为进行性肾小球系膜细胞增生，系膜基质增多，炎性细胞浸润，肾小球毛细血管塌陷，肾小球上皮细胞足突灶性融合，肾小管上皮细胞水样变性，肾小球体积进行性增大。电镜未发现肾小球内电子致密物沉积，直接免疫荧光显示肾组织IgG阴性。相关

2、分析显示，血浆总胆固醇（TCh）及低密度脂蛋白（LDL）浓度与肾小球细胞数、肾小球PAS阳性物质积分光密度值及肾小球体积呈显著正相关。结论：饮食诱导的高胆固醇血症可导致健康大鼠肾脏非免疫复合物介导的病理损害，病变的程度与血浆TCh及LDL浓度呈正相关。关键词高胆固醇血症肾小球损害脂质肾毒性 EFFECT OF DIET-INDUCED HYPERCHOLESTEROLEMIA ON RENAL MORPHOLOGY IN HEALTHY RATSHE YongchengLIAO lütanDING XiaoqiangZHANG YueeXU YuanzhaoXU Yuanding（D

3、epartment of Nephrology，Zhongshan Hospital，Shanghai Medical University，Shanghai200032）OBJECTIVE To study the effect of hypercholesterolemia on renal morphology in healthy ratsMETHODOLOGY Male wistar rats were fed with normal rodent chow（control group）or supplemented with 5 cholesterol（group E）Renal

4、pathology and image analysis were made by light microscope，immunofluorescence，electronic microscope at day 30，60，and 90 RESULTS Significant elevations of plasma total cholesterol（TCh）（2.38±0.84 vs 1.67±0.12 mmolL，P<0.05）and low density lipoprotein（LDL）（1.43±0.41 vs 0.35±0.10 m

5、molL，P<0.05）were found in group E at day 30.Progressive increments in TCh and LDL were observed during the experimentMesangial hypercellularity，increased mesangial matrix，inflammatory cell infiltration and collapsed glomerular lesions were observed in progressive severity in group EElectronic mic

6、roscopic findings showed large amount of lipid appeared in endothelial and mesangial cells，increased number of meangial cells and expanded mesangial matrix and focal fusion of epithelial foot processes in group ENo electronic dense deposit was found in any of the glomeruli examinedDirect immunofluor

7、escence was negative for IgG in kidneys from all groupsImage analysis indicated glomerular enlargement in group EThere was a significant positive correlation between glomerular size and plasma TCh，or LDL levels，number of glomerular cells，or integral light density（ILD）of PAS positive substance in glo

8、meruli CONCLUSION The diet-induced hypercholesterolemia may cause renal pathological injury in rats，the severity of renal injury is closely correlated with plasma TCh and LDLKey words hypercholesterolemia glomerular lesion lipid nephrotoxicityMoorhead等1于1982年首次提出了“脂质肾毒性”（lipidnephrotoxicity）假说，认为脂质代

9、谢异常可导致肾小球的损害及肾脏疾病的进行性发展。其后，一些动物实验已证明了高脂血症与肾损害之间存在密切关系，如发现高脂饮食可使氨基核苷和阿霉素诱导的局灶性肾小球硬化加重，而通过药物降低血浆中脂质浓度可有效防止肾小球硬化2；给正常大鼠及豚鼠喂养高胆固醇饲料，发现高胆固醇血症可导致正常大鼠和豚鼠肾脏病变24。本研究在建立高胆固醇血症动物模型基础上，通过对实验动物连续的生化及肾脏病理形态学观察，以探讨高胆固醇血症对健康Wistar大鼠肾脏形态学的影响。1材料和方法11材料雄性Wistar大鼠，225250 g，平均14周龄（中科院上海动物中心提供），胆固醇（广州化学试剂厂进口分装），VIDS 型半自

10、动像分析仪（英国AMS公司），TJTY-300像处理系统（同济大学太阳电子公司），日立H-500型透射电镜。12高胆固醇血症动物模型制备采用完全随机的方法将Wistar大鼠分为实验组（E组）和正常对照组（C组）。在大鼠的普通饲料中分别按5、1和10的比例掺入胆固醇、胆酸钠和猪油配成粉状饲料，供E组大鼠自由进食、自由饮水，制备成高胆固醇血症动物模型。C组大鼠进食普通饲料。分别于实验第30天、60天和90天（从喂高胆固醇饲料之日算起）进行有关研究。13病理形态观察用3戊巴比妥钠（6 mgkg）腹腔内注射麻醉大鼠，取下右肾，去除外周组织及包膜，肾组织分别置10福尔马林中固定，石腊包埋，切片厚3 m作

11、PAS和HE染色；作冰冻切片（5 m）行油红O（ORO）脂质染色；OCT包埋，置干冰速冻，冰冻切片厚5m，FITC标记抗体，直接法行IgG检查；先固定于含2.5戊二醛的0.2 molL二甲砷盐缓冲液中，再固定于1锇酸，Epon812包埋，半薄切片光镜下定位肾小球，再切片厚50 nm，用醋酸铀和柠檬酸铅双染色后，日立H-500型透射电镜下观察。14肾组织形态定量分析用HE染色切片，选择正切的肾小球，放大400倍行肾小球内细胞计数，每片计数20个肾小球，取平均值。用VIDS 型半自动像分析仪，选择正切的肾小球测定肾小球面积和体积，每张切片测定20个肾小球，取平均值。用TJTY-300型医用像处理系

12、统在灰度207，放大10倍条件下测肾小球一定面积（3100.94 m2）内PAS阳性物质积分光密度（ILD），每张PAS染色切片测10个肾小球，取平均值。15内生肌酐清除率（Ccr）测定根据公式Ccr（mlmin）尿肌酐浓度（molL）血肌酐浓度（molL）×尿量（mlmin）16统计学处理所有数据以均数±标准差（±s），采用两样本均数比较的t检验及直线相关分析。2结果21血浆脂质浓度的变化E组大鼠血浆总胆固醇（TCh）及低密度脂蛋白（LDL）浓度于实验第30天、第60天和第90天显著高于C组（分别为P<0.05，P<0.001和P<0.001）

13、。而两组大鼠血浆甘油三酯（TG）浓度在各期差异均不显著（P0.05），表明该实验性高胆固醇血症动物模型制备成功，见表1。22尿蛋白及肾功能的变化实验周期内两组大鼠24h的尿蛋白排泄及肾功能差异不显著（P0.05），见表2。Table1ChangesoftheplasmaconcentrationsofTCh，DLandTGbetweenGroupEandGroupC（mmolL，±s）30days60days90daysGroupE（n7）GroupC（n5）GroupE（n7）GroupC（n5）GroupE（n7）GroupC（n5）PlasmaConcofTCh238±

14、;084*167±012337±044*185±019522±152*192±020PlasmaConcofLDL143±041*035±010227±067*043±007459±076*058±020PlasmaConcofTG046±019046±012042±007053±010041±018061±016conc：concentration；TCh：totalcholesterol；LDL：lowdensitylip

15、oprotein；TG：Triglyceride*P<0.05*P<0.001 Table2Changesofrenalfunctionandurinaryproteinexcretion（UPE）betweenGroupEandGroupC（±s）30days60days90daysGroupE（n7）GroupC（n5）GroupE（n7）GroupC（n5）GroupE（n7）GroupC（n5）Serumcreatinineconc（molL）601±619548±707530±972530±141637±0906

16、0.1±13.30SerumBUNconc（mmolL）620±121602±214585±171595±053735±124585±123CreatinineClearance（mlmin）094±024092±030083±029106±030084±010095±02424 hoursUPE（mg）634±168574±153599±208546±129561±227520±092conc：conce

17、ntration；*AllthePvalues<0.05 23实验大鼠各期右肾重量及右肾重体重变化实验第60天和第90天，E组大鼠右肾重量及右肾占大鼠体重的百分比均较C组显著增加（P<0.05），见表3。Table3Changesofrightkidneymass（RKM）andRKMbodyweight（BW）inGroupEandGroupC（±s）60days90daysGroupE（n7）GroupC（n5）GroupE（n7）GroupC（n5）RKM（gram）124±008*100±005132±022*115±012

18、RatioRKMBW035±002*032±001041±007*0.32±0.44*P<0.05 24病理形态学改变在实验第30天，E组大鼠肾小球呈现局灶节段性系膜基质增多，细胞数轻度增多及少量炎性细胞浸润，肾小管无明显病理改变。在实验第60天，E组大鼠肾小球系膜基质增多、细胞数增多较第30天更为明显，部分毛细血管腔闭塞及少量炎性细胞浸润，肾小管呈局灶性扩张。在实验第90天，E组大鼠肾小球呈弥漫性基质增多，系膜区扩大，细胞增多更为明显，炎性细胞浸润，毛细血管广泛塌陷，肾小管广泛性浊肿（1，2）。实验周期内各组大鼠肾间质血管无明显病变。在实验各期E

19、组大鼠肾组织油红O（ORO）脂质染色均呈阴性。E组和C组大鼠肾组织免疫荧光检查（IgG）均呈阴性。透射电镜检查发现，E组大鼠肾小球内皮细胞和系膜细胞吞噬脂质，系膜基质增多，系膜细胞增生，上皮细胞足突融合，但未见电子致密物沉积（3，4）。25肾脏组织形态定量测定结果E组大鼠在实验三个阶段肾小球细胞计数均显著高于C组，且实验第90天E组肾小球细胞数显著高于实验第30天E组肾小球细胞数。在实验第30天和第60天，E组大鼠肾小球平均面积和平均体积均显著大于C组大鼠（P<0.01），在实验第90天则极显著大于C组大鼠（P<0.001）。E组中其肾小球平均面积和平均体积在第90天均显著大于第3

20、0天（P<0.002）。在实验第90天，E组大鼠肾小球内代表系膜基质含量的PAS染色阳性物质ILD值显著高于C组（P<0.002），提示实验组大鼠系膜基质较对照组显著增多，见表4。Fig1Attheday90th，diffusivehypercellularity，mesangialmatrixexpansion，andsegmentalcapillarycollapsewerefoundinratsofGroupE(HE×200)Fig2Attheday90th，extensivetubularhypertrophywasfoundinratsofGroupE(HE&#

21、215;200)Fig3LipidmaterialendocytosisbyglomerularmesangialcellinratsofGroupE(EM×5000)Fig4EpitheliumfootprocessfusioninratsofGroupE(EM×6900)Table4ChangesofparametersinpathologicalimageanalysisbetweenGroupEandGroupC（±s）30days60days90daysGroupE（n7）GroupC（n5）GroupE（n7）GroupC（n5）GroupE（n7）G

22、roupC（n5）Glomerularcellularity854±424*718±830899±135*644±370942±330*690±159（cellsperglomerulus）GlomerularPASpositive316±106262±230（materialsILD）Averageglomerularareaof764±088*602±048875±109610±037982±095*598±042PASpositivematerial

23、s（×103m2）Averageglomerularvolumof514±896*358±416629±1160*413±387740±104*355±367PASpositivematerials（×104m3）ForcomparisonbetweenGroupEandGroupC，*P<0.005；P<0.002；*P<0.001Forcomparisonbetweenday30thandday90thinGroupE，P<0.005 26相关分析显示肾小球体积、肾小球细胞数及肾小球内P

24、AS阳性物质ILD值均与血浆Ch及LDL水平呈显著或极显著正相关，且肾小球体积还与肾小球内PAS阳性物质ILD值之间呈显著相关。而血浆TG则与以上各指标无显著相关，见表5。Table 5CorrelationanalysisbetweenserumlipidsandrenalpathologicimageparametersinGroupErats（thervalue）glomerularvolumeglomerularcellularityPAS（）materialILDPlasmaConcofTCh0.822（19）a0.549（10）b0.952（5）bPlasmaConcofLDL0.

25、723（19）a0.473（19）b0.910（5）bPlasmaConcofTG0.196（19）0.032（19）0.084（5）PASmaterialILD0.899（5）ba：P<0.001，b：P<0.005Thenumbersinthe（）aresamplesizenumber 3讨论本研究结果显示，饮食诱导的高胆固醇血症可导致健康大鼠肾脏的一系列病理学改变，包括肾小球体积增大、系膜基质增多、肾小球内细胞数增加、系膜细胞增生、炎性细胞浸润、毛细血管塌陷、内皮细胞及系膜细胞内空泡形成（吞噬脂质现象）、上皮细胞足突融合等，与文献报道高胆固醇血症致肾损伤早期形态学改变一致2，

26、4。在实验第90天，肾小管出现广泛性浊肿，本文未对其原因作进一步研究，可能与高胆固醇血症时膜脂质改变致膜功能异常，包括膜流动性下降，膜通透性异常及膜表面Na-KATP酶活性下降有关。另外，由于脂质过氧化反应增强使磷脂酰丝氨酸(PS)含量下降，致使Na-KATP酶活性下降，导致肾小管上皮细胞水肿68。以上结果表明，高胆固醇血症对健康Wistar大鼠肾脏的形态学具有重要影响。相关分析显示，肾小球体积、肾小球内细胞数及肾小球内PAS阳性物质(主要是系膜基质)的ILD值与血浆TCh及LDL浓度均呈显著正相关。表明高胆固醇血症所致肾脏病理损害程度与血浆TCh及LDL浓度密切相关。本研究中直接免疫荧光Ig

27、G阴性，电镜未见电子致密物沉积，表明高胆固醇血症导致的肾脏病理损害为非免疫复合物介导的炎性损害。本实验中实验大鼠右肾及右肾占体重的百分比显著增加，提示实验大鼠肾脏的绝对重量增加，可能与脂质沉积2，肾小球肥大等病理改变有关。实验大鼠各期肾组织ORO染色均呈阴性，与文献报道不一致2，5，原因尚不清楚，可能与胆固醇酯(CE)含量低有关（ORO不染色游离胆固醇，组织中游离胆固醇在肾脏脂酰辅酶A胆固醇酰基转移酶作用下转化成CE，CE被ORO染色）2。在实验周期内实验大鼠尿蛋白无显著增加，肾功能无显著变化，提示该高胆固醇血症模型早期仅导致健康大鼠肾损伤的形态学改变。综上所述，饮食诱导的高胆固醇血症可导致健

28、康大鼠显著的肾小球病理损害。因此，积极防治高脂血症尤其是高胆固醇血症对防治或延缓肾脏疾病进行性恶化过程具有实际意义。有关高胆固醇血症导致的肾小球内炎性细胞浸润增加，以及其在脂质肾毒性损伤中的作用及其机制，我们将作进一步研究。卫生部科研基金资助项目0789301何永成（上海医科大学附属中山医院肾内科上海，200032）廖履坦（上海医科大学附属中山医院肾内科上海，200032）丁小强（上海医科大学附属中山医院肾内科上海，200032）张月娥（上海医科大学基础医学院病理教研室）徐元钊（上海医科大学附属中山医院肾内科上海，200032）徐元鼎（上海医科大学基础医学院形态研究中心）参考文献1，Moorhead JF，Chan MK，EL-Nahas M et alLipid nephrotoxicity in chronic progressive glomerular and tubulointerstitial diseaseLancet，1982，2：13092，A