中国临床医学样稿

1、溶酶体酶B抑制剂CA-074Me对病毒性心肌炎小鼠心肌保护作用的研究张新刚1 赵刚1 李双杰2 李高平1 陈瑞珍1 杨英珍11复旦大学医学院附属中山医院，上海市心血管病研究所，上海，2000322湖南省南华大学附属第一医院，湖南衡阳，421001摘要 目的：观察溶酶体酶B（Cathepsin B）抑制剂CA-074Me对病毒性心肌炎小鼠的干预作用，并探讨其对心肌保护的作用机制。方法：55只4周龄雄性BALB/c小鼠随机分为对照组（N组，n=10）、病毒模型组（V组，n=15）、低剂量干预组（L组，n=15）及高剂量干预组（H组，n=15）。后3组经腹腔接种柯萨奇病毒B3（CVB3）成功诱发急性

2、病毒性心肌炎，L组和H组于病毒接种后第2天分别腹腔注射CA-074Me 0.4mg/kg和4mg/kg，均连续用7d（第28天）,第15天处死全部存活小鼠，并采血检测血清cTnI以及收集小鼠心脏标本作组织学检测。结果：小鼠感染CVB3 后，其心肌组织中Cathepsin B蛋白表达水平及血清cTnI明显增加；经CA-074Me干预后，Cathepsin B表达以及cTnI降低，心肌损害减轻，小鼠生存率升高，尤其以H组最明显。结论：CA-074Me通过抑制Cathepsin B的表达，减轻心肌损害、提高感染小鼠的存活率，起到保护性的作用，并且对心肌细胞的保护存在明显的量效关系，可为今后临床治疗病

3、毒性心肌炎的研究提供参考。关键词Cathepsin B；CA-074Me；病毒性心肌炎；心肌肌钙蛋白-I Effect of Cathepsin B Inhibitor CA-074Me on the Model of Mice Viral Myocarditis ZHANG Xingang1 Yu Xiaohua2 ZHAO Gang1 LI Shuangjie2, LI Gaoping, CHEN Ruizhen, YANG Yingzhen Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital Fudan Un

4、iversity,Shanghai,200032, China 2The First Hospital Attached to Nanhua University in Hunan Province, Hengyang 421001, China Abstract Objective: To observe the intervention effect of CA-074Me on the model of mouse viral myocarditis, and to explore the possible mechanism of its protection on myocardiu

5、m. Methods: A total of 55 male 4-week-old BABL/c mice were randomly divided into 4 groups: normal control group (group N, n=10), viral myocarditis group (group V, n=15), CVB3 infected and low dose CA-074Me treated group (group L, n=15) and CVB3 infected and high dose CA074Me treated group (group H,

6、n=15). Every mouse in the experimental group was given 0.1 ml coxsackie B3 virus intraperitoneally . At the same time, 0.1 ml of normal saline was treated in group N. From day 2 to day 8, 0.4mg/kg and 4mg/kg Ca-074Me were given intraperitoneally per day in group L and H mice respectively. On day 15

7、the serum was collected to detect cardiac troponin I (cTnI), then all of mice were sacrificed and hearts were removed for histologic study on day 15. Results: The cathepsin B expressional levels and serum cTnI levels were基金项目：国家自然科学基金资助项目（NO：30271665）通讯作者 陈瑞珍： chen.ruizhenzs-increased remarkably aft

8、er CVB3 inoculation. In each of CA-074Me treatment groups, cTnI levels were markedly decreased , meanwhile, the myocardial damage was attenuated and mice survival rate was elevated compared with viral myocarditis group, especially high dose CA074Me group. Conclusion: CA074Me can attenuate the myocar

9、dium injury, and reduce the mortality of mouse with CVB3 myocarditis by inhibition of cathepsin B expression. And the relation between dose and effect is obvious in protecting the myocardium. The study may be a new method for treating viral myocarditis in the future.Key Words Cathepsin B; CA-074Me;

10、Viral myocarditis; Cardiac troponin I病毒性心肌炎与扩张型心肌病关系密切，病毒性心肌炎是引起扩张型心肌病的重要原因之一，相当一部分扩张型心肌病是由病毒性心肌炎迁延不愈演变而成，有人认为病毒性心肌炎和扩张型心肌病实际上是一种疾病的两个阶段。我们前期的研究1结果表明，扩张型心肌病患者心肌组织中27kd活性形式的Cathepsin B的表达增加，且表达量与患者的心功能（EF值）呈负相关。目前已有相关文献 2,3 报道抑制Cathepsin B的生成与活性能阻止细胞凋亡，减轻细胞损伤。因此，本研究拟通过建立病毒性心肌炎小鼠模型，在此基础之上予以一定剂量的Cathep

11、sin B抑制剂CA-074Me干预，观察其对小鼠心肌细胞的保护作用，为病毒性心脏病的治疗提供新的理论和方法学依据。1资料与方法1.1 病毒、实验动物与主要试剂柯萨奇病毒B3（CVB3）Nancy株由本院卫生部病毒性心脏病重点实验室提供，病毒原液效价为10-7 TCID50，实验用量为100 TCID50；BALB/c小鼠由复旦大学动物实验中心提供，并在SPF级环境下饲养，4周龄，雄性，体质量1216g，共55只。Cathepsin B抑制剂CA-074Me购自美国Biomol Research Laboratories，cTnI试剂盒购自美国Dade Behring公司，羊抗鼠多克隆抗体及马

12、抗羊二抗均购自Santa Cruz 公司。1.2 心肌炎模型的制备和分组55只小鼠随机分为4组：对照组（N组，n=10）、病毒模型组（V组，n=15）、低剂量干预组（L组，n=15）、高剂量干预组（H组，n=15）。对照组小鼠每只腹腔注射不含病毒的病毒培养液0.1 ml，后3组每只鼠经腹腔接种100 TCID50的病毒稀释液 0.1 ml诱发心肌炎。将CA-074Me溶于二甲亚砜（DMSO）中，L组和H组于病毒接种后第2天分别腹腔注射CA-074Me 0.4mg·kg-1和4mg·kg-1（剂量参照Maekawa等4的研究），每天1次共7次，病毒模型组同时注射等体积的DMS

13、O。1.3 标本的留取接种病毒后第15天，用摘动物眼球法取全血约0.51ml，分离血清冻存，然后以颈椎脱臼法处死动物取心脏，将其沿左室中线切为两半，一半用甲醛固定，石碏包埋后，作病理组织学和免疫组化检测，另一半迅速放入液氮，再转移至-70冰箱中保存备用。1.4 心肌组织中Cathepsin B蛋白表达的测定按常规ABC法进行免疫组化染色，Cathepsin B阳性表达细胞胞浆内可见明显棕黄色颗粒。在400倍光镜下随机选取3个视野，利用Imagetool 2.0软件计数，得出每视野阳性颗粒数，取其平均值作为免疫组化结果。1.5 血清肌钙蛋白（cardiac troponin I,cTnI）的测定

14、随机选取N组4只鼠，V组、L组和H组各7只鼠，测定血清cTnI，用OPUS plus型自动生化仪（Dade Behring公司）进行检测（评判标准cTnI>0.1ng·ml-1）。1.6 病理组织学检查将甲醛固定的小鼠心脏标本常规脱水、石碏包埋、切片、HE染色、光镜下观察心肌病理变化。1.7 统计学分析所有数据均以均数±标准差表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析及两两比较，生存率评定用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。全部资料用SPSS11.0软件包进行统计学分析。2 结果2.1 生存曲线对照组在最上方呈一直线，提示无死亡发生，H组、

15、L组及V组呈不同程度的阶梯形下降趋势，以V组最为明显。生存分析结果示，经统计学检验，L组与V组差异无统计学意义（P>0.05）；而H组的生存曲线明显优于V组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）(图1)。图1 4组鼠的14d生存曲线比较2.2 心肌病理组织学变化N组心肌排列规则，胞浆着色均匀，无炎性细胞浸润；V组可见病变的心肌细胞坏死崩解，胞核和细胞轮廓消失，周围出现大量的炎症细胞浸润，间质内可见较多的胶原纤维；V组和H组上述病变明显减轻，尤以H组心肌改善最为显著，仅见有少量的坏死灶和炎性细胞浸润（图2）。2.3 心肌组织Cathepsin B蛋白的表达N组心肌细胞胞浆中可见一

16、定量的呈棕黄色的阳性颗粒；V组心肌细胞胞浆中阳性颗粒明显增多，着色明显加深，呈深棕黄色；L组心肌组织和H组心肌组织阳性颗粒较N组和V组明显减少，其中H组减少最为明显（P<0.01），见表 1与图3。表1 4组鼠Cathepsin B检测结果比较组别NCathepsin B（个阳性颗粒）N组10675.6±143.48V组151196.07±240.36aL组15844.87±174.62 bH组15264.53±60.61 c与N组相比，aP<0.01；与V组相比，bP<0.01；与L组相比，cP<0.012.4 血清肌钙蛋白定量

17、变化N组和H组部分血清cTnI值太低，Dade Behring公司OPUS plus型自动生化仪检测提示结果小于0.1ng·ml-1。为统计方便仍计作0.1ng·ml-1。V组cTnI值较N组明显升高，经CA-074Me干预后，cTnI值显著降低(P<0.01)（表2）。表2 4组鼠cTnI检测结果比较组别NcTnIN组100.101±0.002V组154.803±2.716aL组150.459±0.259bH组150.136±0.035与N组相比，a P<0.01；与V组相比，bP<0.013 讨论 Catheps

18、in B是溶酶体中重要的一种蛋白水解酶，属半胱氨酸蛋白酶，以酶原的形式贮存于溶酶体中，分子量38kd，释放至胞浆，被溶酶体中其它的蛋白水解酶水解或自身激活形成27kd的活性形式，大量研究5,6表明，Cathepsin B可介导凋亡的发生。CA074Me，是一种甲基化的环氧氯琥珀酰胆碱，属于选择性的Cathepsin B抑制剂，在体内外均有作用。cTnI小部分存在于心肌细胞胞浆中，大部分在心肌肌原纤维中与收缩蛋白呈结合状态，心肌损伤后心肌细胞胞浆中cTnI首先释放，肌原纤维中与收缩蛋白结合的cTnI再缓慢逸出，因而在心肌损伤（如急性心肌梗死）后1周内血清中仍可测到cTnI，从而提高了诊断的敏感性

19、。正因为cTnI存在着高特异性和高敏感性，因此，检测小鼠血清中cTnI的浓度，能很好的反映病毒性心肌炎心肌损伤的程度。本研究结果表明，小鼠感染CVB3后，其心肌组织中Cathepsin B蛋白表达水平及血清cTnI明显增加；经CA-074Me干预后，Cathepsin B表达以及cTnI降低，心肌损害减轻，小鼠生存率升高，其中高剂量干预组效果优于低剂量干预组，这些研究结果显示CA-074Me对心肌细胞有明显的保护作用，能降低病毒性心肌炎小鼠的死亡率，并且对心肌的保护存在明显的量效关系，具体的机制可能与其抑制Cathepsin B的生成与活性，减少Cathepsin B介导的心肌细胞凋亡有着密切

20、的关系，这有待于以后的研究阐明。参考文献1 赵刚, 李双杰, 陈瑞珍,张新刚，杜九中，李高平，杨英珍. Cathepsin B与扩张型心肌病发病关系的初步探讨J. 复旦学报（医学版）,2004,31(6):556-558.2 Madge LA, Li JH, Choi J, Pober JS. Inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase sensitizes vascular endothelial cells to cytokine-initiated cathepsin-dependent apoptosisJ. J Biol Chem, 2003, 278(23):21295.3 Yamashima T, Kohda Y, Tsuchiya K, et al. Inhibition of ischaemic hippocampal neuron