组定稿的学位和答辩金红林博士

1、A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements forthe Degree of Doctor of Philosophy in ScienceLipoprotein-based nanoplatform for cellular siRNA deliveryPh.D.Candidate: Honglin JinMajor: Biochemistry and Molecular BiologySupervisor: Prof. Zhihong ZhangAssociate Supervisor: Prof.

2、 Gang ZhengHuazhong University of Science and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R.July, 2011独创性本人所呈交的是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明的内容外，本不包含任何其他个人或集体已经或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全本的法律结果由本人承担。作者签名：日期：年月日使用书本作者完全了解学校有关保留、使用的规定，即：学校保留并向有关部门或机构送交的复印件和，被查阅和借阅。本人华技大学可以将本的全部或部分内容编入

3、有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等保存和汇编本。，在年后适用本书。本属于不。（请在以上方框内打“”）作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月华技大学博士1摘要小干扰RNA（siRNA）能够沉默疾病相关的表达,但是如何有效地这些高负电荷的仍具有性。寻找和开发无毒且高效的siRNA递送来实现特定的沉默一直是研究热点。天然脂蛋白（低密度脂蛋白LDL和高密度脂蛋白HDL）是内源性的纳米颗粒，作为载体已具有悠久的历史，而人工模拟脂蛋白是一种新型的、具有临床应用潜力的纳米载体。本文建立和发展了以LDL和仿HDL纳米颗粒为载体的siRNA递送下研究结果*：，解决了siRNA的靶向和胞浆等，

4、取得了以（1）使用纯化的 LDL 纳米颗粒地实现了功能性 siRNA 的靶向递送。当siRNA 共价耦联到醇后，每的 LDL 上可装载超过 25的醇-siRNA（chol-siRNA），形成的复合纳米颗粒 LDL-chol-siRNAs 保持了 LDL 的形态、结构和功能。实验结果表明， LDL-chol-siRNAs 能够经由 LDL 受体介导的内吞途径选择性地被细胞摄取，其抑制效率是单独使用 chol-siRNA 的 2.1 倍。，此有一定的局限性，因为受体介导的内吞途径使得 LDL-chol-siRNAs 主要蓄积在内体/溶酶体中，若能解决 siRNA 的胞浆，将有望获得更好的沉默效果。

5、（2）提出采用光化学内化（PCI）法促进 LDL 运载的胞浆，发现 PCI法对 LDL 表面装载的具有最佳的胞浆效果。我们使用三种不同类型的荧光以模拟化疗，通过不同的分别装载到 LDL 中，到磷脂单层外膜 （表面装载），耦联到 apoB-100 蛋白的特定氨基酸上（蛋白标记法），重组进入 LDL 的脂质（装载）。荧光显微成像结果显示，这些载药的 LDL纳米颗粒均是通过 LDL 受体介导的内吞机制进入人肺癌细胞 A549 中的。当使用 PCI 法后，通过比较光照前后细胞内荧光信号变化的倍数，显示出不同装载类型的胞浆程度：LDL 表面装载的DiI量最大，脂蛋白耦联标记的染1 基金资助：科学研究计划

6、项目（2011CB910401），NSFC-CIHR 中加健康研究合作计划（NSFC-30911120489, CIHR CCI-102936）I华技大学博士料 FITCFluo-BOA 胞浆程度次之，装载的效果不佳。此结果表明，PCI 法诱导的 LDL 装载的胞浆，与 LDL 的载药方式密切相关，因而尤其适用于解决LDL 表面装载chol-siRNA 的胞浆。引入PCI 法后，LDL-chol-siRNA的沉默效果随着光照的时间增加而提高，到最大光照时间为 180 s 时，抑制效率从 38%提高到 78%。（3）利用 HPPS（仿 HDL 纳米载体）靶向清道夫 B 类 I型受体（SRB1）的

7、机制，建立了一种新的纳米载药能将 siRNA 直接到细胞胞浆中。实验结果显示，每HPPS 可有效地装载 8的 chol-si-bcl-2 （醇修饰的 siRNA 靶向 bcl-2），形成的 HPPS-chol-si-bcl-2 纳米颗粒保持了良好的结构完整性和纳米颗粒的均一性，对 SRB1 高表达的细胞具有明显的 Bcl-2 蛋白表达抑制效果，而对 SRB1 低表达的细胞无此功能。通过荧光共聚焦成像和亚细胞碎片分离技术进一步证实，HPPS-chol-si-bcl-2 在胞内的摄取涉及到一种直接的胞浆转运机制。与单独的 chol-si-bcl-2 相比，HPPS-chol-si-bcl-2 在

8、Bcl-2 蛋白表达的抑制和促凋亡方面分别有 4.8 倍和 2.5 倍的增加。直接的胞浆机制和良好的生物相容性使得HPPS尤其适合于递送胞内活性的干扰。（4）地将靶向表皮生长因子（EGF）耦联到 HPPS 上，使得 HPPS 的靶向性由 SRB1 转换为 EGF 受体，拓展了 HPPS 在肿瘤靶向诊疗中的应用范围。建立了评价纳米颗粒靶向性的双色荧光标记，双色荧光成像证实装载有近红外荧光DIR-BOA 的 EGF-HPPS 能够被高表达绿色荧光蛋白（GFP）-EGFR 的细胞特异地识别与摄取，而不表达 GFP-EGFR 的细胞则无 DiR-BOA 荧光信号。本研究利用脂蛋白和人工模拟脂蛋白作为

9、siRNA 的递送载体，分别采用 PCI 法和 SRB1 特异性机制等，有效地解决了 LDL 和 HPPS 运载 siRNA 过程中的胞浆，为脂蛋白纳米载体成为高效的 siRNA平台提供了技术支撑，同时也为肿瘤的靶向治疗带来了新的机遇。采色荧光成像的证实和鉴定了 EGF-HPPS 的特异靶向性，拓展了 HPPS 在肿瘤靶向诊疗中的应用范围，也为分析协同靶向与目标靶向间的相互作用提供了实验。II华技大学博士：肿瘤靶向性，纳米颗粒，脂蛋白，小干扰核糖核酸，胞浆递送，光化学内化法III华技大学博士AbstractAlthoughsmallinterferingRNA(siRNA)cansilence

10、theexpressionofdisease-related genes, delivery of these highly charged molecules is challenging. Deliveryapproaches for siRNA are actively being pursued and improved strategies are required fornon-toxic and efficient delivery for gene knockdown. Lipoproteins (LDL and HDL) arenatural and endogenous n

11、anoparticles that have a rich history as delivery vehicles, whilelipoprotein mimetics are novel nanocarriers that can be clinically translationable. Thisstudy examined LDL nanoparticles and HDL miing peptide-phospholipid scaffold(HPPS) as nanocarriers for siRNA delivery and overcome the siRNA delive

12、ry problems, including targeting delivery and cytosolic release.1) We used purified LDL nanoparticles as carriers for functional siRNA delivery. When siRNA was covalently conjugated to cholesterol, over 25 chol-siRNAs could be incorporated onto each LDL without changing nanoparticle morphology. The

13、resulting LDL-chol-siRNAs nanoparticles were selectively taken up into cells via LDL receptormediated endocytosis, resulting in enhanced gene silencing compared to free chol-siRNA(39% gene knock down versus 0% knock down at 100 nM). However, silencing efficiencywas limited by the receptor-mediated e

14、ntrapment of the LDL-chol-siRNA nanoparticles inendosomes. Photochemical internalization demonstrated that endolysosome disruptionstrategies significantly enhance LDL-mediated gene silencing.2) We introduce the cytosolic release of Low density lipoprotein nanoparticles (LNPs) loaded cargos using pho

15、tochemical internalization (PCI) approach. Three types of fluorescent dyes mi ing the therapeutics were loaded onto LNPs via various approaches, including intercalation in the phospholipids monolayer exterior (surface loading), conjugation to the amino acids of apoB-100 protein (protein labeling) or

16、reconstitution into the lipid core of LDL (core loading). Fluorescence imagingIV华技大学博士demonstrated the cellular uptake of cargo-loaded LDL nanoparticles (CLNPs) wasthrough LDL receptor (LDLR) mediated endocytosis in the lung cancer A549 cells. Whenthe PCI was performed, the measurement of fluorescen

17、ce changing folds before and postirradiation showed a varying degree of cargo release, a large amount of DiI release, partsof FITC release and seldom Fluo-BOA release. Thus, PCI is well-suited to improve LDLmediated siRNA delivery efficiency. Together, this study demonstrated the effectiveness of cy

18、tosolic release of LDL loaded cargos was loading methods dependent, as well as providing insight into the design of drug release using PCI.3) We report a novel approach to efficiently deliver siRNA into the cytosol of cancer cells via the scavenger receptor class B type I (SRB1) pathway. This was ac

19、complished by using a HDL-mi ing peptide-phospholipid scaffold (HPPS) as a nanocarrier andcholesterol-modified siRNA targeting bcl-2 gene (chol-si-bcl-2) as the siRNA payload.Eight chol-si-bcl-2 molecules were stably incorporated into each HPPS particle whilemaintaining its structural integrity and

20、homoge. Bcl-2 protein expression was silencedby the resulting HPPS-chol-si-bcl-2 in SRB1 over-expressing cells but not in SRB1low-expressing cells. Direct cytosolic transport of HPPS-chol-si-bcl-2 was confirmed byconfocal imaging and subcellular fractionation assay. Compared with chol-si-bcl-2 alone

21、， HPPS-chol-si-bcl-2 down-regulated Bcl-2 expression by 4.8-fold and increased apoptosis by 2.5-fold. The direct cytosolic delivery mechanism and biocompatibility of HPPS are uniquely suited for the delivery of intracellular active RNAi therapeutics.4) We use a fluorescence imaging approach to show

22、that HPPS conjugated toepidermal growth factor (EGF-HPPS) are able to specifically recognize and target lung cancer cells expressing a GFP-labeled epidermal growth factor receptor (EGFR-GFP).This study provides a framework for evaluation and validation of specific nanoparticletargeting ligands using

23、 fluorescence imaging.Here we investigated the use of lipoproteins and lipoprotein mimetics as carriers forV华技大学博士siRNA delivery. By the use of PCI and the specific delivery mechanism of SRB1, thecytosolic delivery of siRNA was achieved for LDL and HPPS, respectively, making themuseful tools for the

24、 cytosolic delivery of siRNAs, as well as providing potentialopportunities for the gene therapy using siRNAs. Using a dual fluorescent imagingtechnique, we validated the specific targeting ability of EGF-HPPS, which woulddramatically extend the application of HPPS in cancer therapy. In addition, it

25、provided a useful technique for the validation of the influence of unintended targets on the desiredligandreceptor interaction.Keywords:tumor targeting, nanoparticle,photochemical internalization.lipoprotein,siRNA,cytosolicdelivery,VI华技大学博士目录摘要IAbstractIV1 绪论1.1 RNAi 的发展简介(1)1.2 siRNA 递送的研究进展(9)1.3

26、脂蛋白纳米颗粒作为载体的理论基础(15)1.4 脂蛋白纳米载体的应用以及新型人工脂蛋白纳米载体研究(21)1.5 选题背景和本文主要内容研究(25)2 基于 LDL 纳米载体的 siRNA 递送及其胞浆研究2.1引言(28)2.2. (29)实验材料和2.3实验结果(39)2.4讨论(57)2.5本章小结(58)3 基于仿HDL 纳米载体的 siRNA 递送研究3.1引言(59)3.2. (59)材料和3.3实验结果(65)VII华技大学博士3.4 讨论(71)3.5 本章小结(72)4 仿 HDL 纳米载体靶向性变更的双色荧光成像4.1引言(73)4.2. (74)材料和4.3结果(75)4

27、.4讨论(82)4.5本章小结(83)5 结论与展望5.1研究结果(84)5.2主要创新点(85)5.3展望(86)谢(87)致参考文献(89)附录 1 攻读学位期间目录(106)VIII华技大学博士1 绪论1.1 RNAi 的发展简介1.1.1 RNAi 的发现RNA 干扰（RNA interference，RNAi）现象是一种进化上保守的抵御外来的防御机制1。将与靶或的转录产物 mRNA同源互补序列的双链RNA(double strand RNA ， dsRNA)导入细胞后被特定地裂解为 siRNA（ smallinterference RN段，能特异性地降解该 mRNA，从而产生相应功能

28、表型的，这一过程属于转录后沉默机制范畴。RNAi 广泛于生物界，从原核生物到植物、真菌、无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，只是机制也更为复杂2。早在1990年Napoli在进行转植物有关研究时发现，将全长或部分导入植物细胞后某些内源性不能表达，但这些的转录并无任何影响，并将这种现象称为转录后沉默（posttranscriptional gene silencing，PTGS）3。1996 年在脉孢菌属（Neurospora）中发现了相似现象，只不过将这种现象命名为表达的阻抑作用（ quelling ） 4 。首次发现dsRNA 能够导致沉默的线索来源于线虫Caenorhabdi

29、tis elegans 的研究5。1995年康乃尔大学的研究Guo和Kemphues尝试用反义RNA去阻断par-1的表达以探讨该的功能，结果反义RNA的确能够阻断par21的表达，但是奇怪的是，注入正义链RNA作为对照，也同样阻断了的表达6。1998年，的Andrew Fire和马萨诸塞大学卡耐基中心的Craig Mello首次将双链dsRNA的正义链和反义链的混合物注入线虫，结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要好的沉默效果5。当时，沉默技术主要利用反义寡聚核苷酸，它主要利用一条与靶向的mRNA互补的单链DNA或者RNA来实现。2002年，Bertrand在细胞和水平比较了寡聚核苷酸和d

30、sRNA对于绿色荧光蛋白的1华技大学博士沉默效果，发现在细胞水平上siRNA的作用更加显著，而且在水平siRNA也能产沉默效果，寡聚核苷酸基本不起作用7。Dykxhoorn在2003年发现dsRNA生与siRNA的最大不同是，siRNA具有一种类似催化的特性，即每反复利用来清除多的mRNA8。自 2001 年，首次证明 siRNA 在哺乳细胞中能代替 dsRNA 产生的siRNA可以被沉默以来，RNAi 迎来了前所未有的关注9-11。它被Science杂志评为 2001 年的十大科学成就之一。2002 年 RNAi 的研究又有了新的，发现它在表达调控中发挥重要作用，它被 2002 年Scien

31、ce杂志评为十大科学成就之首。2006 年，Andrew Fire 和CraigMello由于最先发现了 RNAi，被评选为当年的生理和药理学的奖获得者。图 1-1 RNAi 的发展历史。图片节选自 invitrogen 公司。-Overview.htmlFig. 1-1 The development of RNAi in the history. This figure was selected from the Invitrogenwebsite.2华技大学博士1.1.2 RNAi 的机制RNAi作用机理的首次研究主要是在果蝇提取物中阐明的。利用RNA酶（一种能切割双链RNA的酶）的Di

32、cer酶把长的dsRNA（500-1000核苷酸）降解为小的siRN段9, 12。Dicer酶广泛于蠕虫、果蝇、真菌、植物及哺乳动物体内。它的结构中一个螺旋酶结构域，两个RNA酶结构域，和一个双链RNA结合位点。在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21到23个核苷酸的片断，并且在两条链的3'端均悬挂有2个核苷酸，此片段即为siRNA。过的siRNA首先与一个蛋白复合物形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）13。Dicer酶也参与了早期的RISC形成过程，据推测此步骤是siRNA形成RISC过程中必须的。在哺乳动物细胞中，

33、Argonaute 2 （Ago2）蛋白是RISC的活性催化组分，直接参与了靶向mRNAs的降解2, 14。在RISC的装配过程中，siRNA首先以双链的形式被装载到Ago2上，接着siRNA双链中的过客链（正义链）被Ago2降解并将引导链（反义链）出来，最终形成活化的RISC15, 16。引导链作为识别同源mRNA的模板，当靶向的mRNA与RISC相结合后，第10位与第11位（相对于引导链的5'）的碱基将被Ago2特异性的切开10。但是此模板siRNA将被降解，RISC可以经历大量的mRNA降解的循环，因此具有较高的RNAi效率2。过客链被Ago2降解的方式与RISC降解靶向mRNA

34、的方式类似15。另外，RNA干扰也可以通过小实现17。调控RNA（microRNA）来在哺乳动物与其它真核生物中实施RNAi有很大的区别，其中最大的不同在哺乳动物中缺乏长期持续的RNAi放大机制。比如，在果蝇中，35的dsRNA能够降解约1000/细胞的靶标mRNA，并且能持续很多代18。相反，在哺乳动物细胞中，h19由于细胞在过程中的稀释，RNAi只能有效地持续约663华技大学博士1.1.3 产生 siRNA 的产生siRNA的可以分为3类，化学、体外转录和内源性的表达。三种方法均具有自身的优点和缺点。具体使用哪一类决定于靶标、细胞类型、细胞或实验以及期望得到的效果20。siRNA化学法是s

35、iRNA最直接的，因为它具有能精确siRNA的产量和纯度，易于鉴定和放大，而且便于对特定的碱基进行化学修饰以增强其性9。化学siRNA需要两条同源链，通过退火以及一些额外的能增加性的化学修饰，来确保有两个碱基悬挂于末端。跟DNA不同的是，RNA每个核糖骨架具有一个额外的羧团，一般在DNA的碱性环境下会产生降解。因此，的一步是同时要保护5'和2'的羧团8。使用化学RNA最siRNA也存在一些缺点，比如成本较高，只能产生瞬时的沉默效果以及由于的siRNA产物的单一性导致沉默效果的不确定性。siRNA 的体外转录法。由于化学进行体外转录成为了产生 siRNA 的另外比较昂贵，使用 T

36、7 RNA 核糖核酸聚合酶法。首先利用自动化的 DNA仪，含有 T7 RNA 核糖核酸聚合酶启动子区域的序列以及紧连着所期望得到的 RNA 序列作为 DNA 模板，然后使用 PCR 来进行扩增。T7 聚合酶结合到启动子序列上， 启动转录过程并朝向模板的 5'末端延伸21, 22。在 DNA 上加上终止区域，可以用来停止转录，另外也可以利用失控转录，当扩增到达 DNA5'末端时自动停止也是很常见。转录的 PCR 片段包含有正义链和反义链，它们自发地退火形成全长的的dsRNA。但是此也受 T7 聚合酶的影响，具有很大的局限性，由于 T7 启动子最后一个碱基是鸟嘌呤核苷（G），决定了

37、 RNA 的第一个核苷酸必定是 5'G，所以此限制了 siRNA 的序列21。Kim 发现从 T7 聚合酶得到的 siRNA 在许多细胞中能导致干扰素 和 的产生，使用其它的 RNA 聚合酶获得的单链 RNA 也具有同样的21。进一步的研究发现，T7 转录本的 5'末端的三磷酸盐是导致产生干扰素的原因。在此基础上，Sohail 使用脱氧核酶对 T7 转录本进行酶解获得了所需要的 siRNA序列23。虽然使用脱氧核酶对 RNA 进行酶解的过程发生在两个比较特定的核苷酸位4华技大学博士点24，但可以采用不同的脱氧核酶，根据此二核苷酸的不同，可以得到各种想要的siRNA 序列，此更加

38、灵活。一般来说，通过这种酶解的得到的 siRNA，比纯化学能产生更好的抑制效果，因为酶解产生的 siRNA 能覆盖整个。而较化学的 siRNA，由于混合的 siRNA 中也会一些可能靶向其它的序列，也许会导致一些非特异性的沉默。另外，酶解法也需要进行 siRNA 分离，将 siRNA 与未酶解的 RNA 双链和残余的碱基分离25, 26。图1-2 RNAi的作用机制。RNAi是由长的双链RNA（dsRNA）、小干扰RNA（siRNA）、质为基础的短发夹RNA（shRNA），或microRNA（miRNA）触发而产生的。dsRNA、shRNA粒或和miRNA的前体由Dicer酶成21-23 nt

39、的siRNA双链，该在3'和5'分别具有2个碱基的。组装的siRNA与细胞内特定的蛋白形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）。突出和磷酸在RISC形成的过程中，其中一条链开始脱离，而另一条链（引导链）产生活性的RISC，最终触发特定序列的mRNA降解或转录后的抑制。以上图片选自参考文献20。Fig. 1-2 Mechanisms of RNA interference (RNAi). RNAi is triggered by long double-stranded RNA(dsRNA), small interfering RNA (siRNA), plasmid or-ba

40、sed short hairpin RNA (shRNA), ormicroRNA (miRNA). Long dsRNA, shRNA, and pre-miRNA are processed by Dicer into 21-23 nt siRNA duplexes with symmetric 2-nt 3' overhangs and 5'-phosphate groups. Processed siRNAs assemble with cellular proteins to form an RNA-induced silencing complex (RISC).

41、During RISC assembly, one strand (passenger) is eliminated, while the other strand (guide) produces an active RISC, which eventually triggers the sequence-specific mRNA degradation (in case of total complementarity) or translational repression (in case of incorporation of partially complementary miR

42、NA). This figurewas generated from the reference 20.5华技大学博士siRNA的内源性表达是指使用siRNA或者shRNA的表达盒，经过Dicer处理后获得类似pre-miRNA类的产物。这些shRNA可以通过质粒或者表达载体来获得，以达到短暂或者持久的抑制目的。但是，此类也有不足之处，如构建质粒比较27。费时费力以及质粒也转染等1.1.4 siRNA 应用于治疗的RNAi的发现和发展正在而且将会给疾病治疗带来难以应用前景。但是，28。在无论是细胞层次上还是内，使用siRNA进行干扰均要克服很多细胞层次上，a）siRNA带有大量的负电荷，并且量

43、大（13 KD），自身很难穿载体来实现；b）生化过细胞膜的屏障，siRNA主要靠化学修饰和一些性：由于siRNA是由大量的核糖核酸，很容易被外界的RNA酶所降解。因此，在进行siRNA的设计和选择载体时，必须充分考虑到siRNA的生化性。一般可以对碱基进行特定的化学修饰或者采取使用载体保护的，来防止在未进入作用位点时siRNA过早被环境中的RNA酶降解；c）脱靶效应（off target effect）：Jackson和Sioud发现一些siRNA能导致一些非特异性的序列依赖性29。因此，进行siRNA的序列设计时，在保证沉默，此反应具有浓度和抑制效果的同时尽可能选择低脱靶效应的序列；d）激活

44、免疫反应：一般在哺乳类动物细胞内会表达Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）来识别病原相关的，比如未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG二核苷酸）和的dsRNA30。siRNA同样类似的识别途径，后，最终导致许多细胞因子的，比如核因子B（nuclear在激活一系列的信号factor B，NF-B）、干扰素调节（interferon regulatory factors，IRFs）和胞翻译起始因子2（eukaryotic translation initiation factor 2，EIF-2）。由于siRNA被TLRs识别的过程主要发生在内涵体中，如果可以及时且

45、有效的将siRNA从内涵体到胞浆中，将能避免激活细胞免疫反应。另外大多数的子纳米载体也会激活细胞的免疫反应；e）到达细胞内的有效作用位点：siRNA的作用位点主要在细胞6华技大学博士胞浆内，如何有效地将siRNA或者到胞浆中是影响RNAi效果的瓶颈。机制十分必要28。因此，引入有效的siRNA图 1-3 siRNA 全身给药所的生理屏障。纳米载体经注射到体内后必须有效地避免肾脏的过快清除、免疫系统的吞噬和血液中的降解；必须有效的越过内皮细胞；穿过组织细胞外的基质层；进入到细胞中；脱离内体；有效地siRNA 到胞浆中并发挥RNAi 的沉默机制（文献 28）。Fig. 1-3. Physiolog

46、ical barriers to the systemic delivery of siRNA. An injected nanoparticle must avoid filtration, phagocytosis and degradation in the bloodstream; be transported across the vascular endothelial barrier; diffuse through the extracellular matrix; be taken up into the cell; escape the endosome; and unpa

47、ckage and release the siRNA to the RNA interference (RNAi) machinery. Thisfigure was generated from the reference 28.应用 siRNA 进行治疗的最终目的是能对病变组织进行有效的，这就要求siRNA 必须能克服各种到达病变组织相关的部位。中 siRNA 给药可以采用局部或者静脉注射的方式。局部注射的高压注射和电穿孔法等，但是此类自身的不足，比如需要大体积的注射和一定的生理毒性等。在更多的情况下，一般会首选 siRNA 静脉注射的方式31-34。经全身给药后，siRNA 除了要克服

48、以上提到的细胞水平的之外，还会受到一些其它因素的制约（如图 1-37华技大学博士所示）：a)血液循环系统：siRNA 必须避免肾脏的快速清除和血液细胞的吞噬，减少与血液中脂蛋白的相互作用35-37；b)穿过内皮：内皮对于特定的组织摄取 siRNA 有影响。一般 5 nm 以上的不易穿过毛细管壁，导致它们一直停留在血液循环中直到被清除。但是对于特定的组织（比如肝脏、肾脏和绝大多数的肿一些较大的（200 nm）通过。瘤），它们可以于实体肿瘤组织，相对较小的纳米材料（40 nm）成为了理想的载体1；c) 组织细胞外基质：组织细胞外基质由浓密的多糖和组成的网状组织，对体内大和纳米载体产生阻力，它们不仅

49、可以减缓或者终止siRNA 提供了机会38。因此，过程，而且还为基质周围的巨噬细胞摄取的 siRNA 必须要穿过组织细胞外基质才能有机会到达靶向的组织细胞。d) 靶向性：将 siRNA 靶向到所的组织与细胞中，不仅可以提高治疗的效率，而且可以减少对其它非特异性组织的副作用。siRNA的靶向性一般可以通过引入外源性的靶向来实现。1.1.5 siRNA 作为治疗的应用具有 RNA 干扰作用，且能进行化学和修饰使得 siRNA 成为了潜在的治疗性。精确的化学修饰和序列设计不仅能减少脱靶效应的产生，还能使之具有特定的功效而不产生额外的毒性。正是由于具有这些特性，siRNA 在疾病治疗上的应用受到了广泛

50、的关注。在治疗方面，应用 siRNA 进行治疗与传统的治疗最关键性的区别在于：传统的化学具有有限的作用靶点，并且其治疗效果的评价主要于症状的减轻；治疗是在形成了疾病相关的蛋白之后采取的治疗方案，而 siRNA 治疗通过抑制疾病相关蛋白的源上进行治疗28。表达来有效地疾病，从而可以从根早在 siRNA 被发现作为反义核酸技术之前，已经有一些反义核苷酸在治疗性的应用上取得了进展。其中一种名为 VitraveneTM（Fomivirsen）的寡聚核苷酸和名为 MacugenTM（Pegatinib）的适体（aptamer）已经获得了美国食品及管理局（FDA）的39。受到这些反义核苷酸的启发，siRN

51、A 已经开始应用于几乎各种疾病的治8华技大学博士疗研究中，至今已有至少 13 种以上的干扰治疗方案进入临床试验。虽然有些早期临床结果获得了一些成效，但是目前没有一种静脉注射的 siRNA 相关的进入市场。siRNA 要进入市场还要间隔时间选择、特异性和安全性等很多待解决的，比如靶向性、功效、治疗的。想要解决这些，还得从 siRNA 的递送研究入手。1.2 siRNA 递送的研究进展1.2.1 siRNA 递送概述siRNA 治疗的关键是如何将siRNA 有效地到靶标mRNA 附近并促进mRNA的降解。虽然通过碱基的化学修饰可以排除一些因素的制约，但是它们不能解决31, 40。理想的siRNA

52、的载体和不仅能辅助 siRNA 穿过各组织分布种生理屏障到达组织与细胞内的作用位点，而且能最大限度地将 siRNA 运送到靶向的组织与细胞中，同时减少 siRNA 在非靶向的组织和中的摄取。目前 siRNA 的载体主要分为载体和非载体。由于大多数的载体一定程度的和载体在 siRNA副反应，因此难以应用于临床。本节将重点非的方面的进展。流体力学尾静脉注射法采用大体积、快速注射的能将 siRNA 导入到肝脏中，主要可能是高压注射引起膜扰动造成的31-34。研究发现给大鼠注射修饰的和化学修饰的内皮生长以因子（Vascular endothelial growth factor ，VEGF）特的生成4

53、1，异性的 siRNA 均可以抑制病理新，大体积的注射和由此产生的侵入性的细胞毒性限制了其在临床治疗上的应用。目前，采用电脑引导的注射方式极大地提高了此的精确性和重复性42。和导管电穿孔法是采取电脉冲的来转染细胞，对一些难转染的细胞也有很好的效果。其机理主要是靠电脉冲产生的热量促使细胞膜上的磷脂发生相变而翻转，从而产生膜局部的扰动和亲水性的孔，使得 siRNA 可以较容易的进入细胞内。虽然此方法具有较高的转染效率，但是也同时导致了较低的细胞存活率。通过改变一些9华技大学博士参数，比如电压、间距和脉冲的数量可以不同的细胞进行条件优化，获得最大的转染效率的同时减少细胞的毒性43-45。Golzio 使用电穿孔法，在动物体内注射siRNA 获得了长达 23 天的沉默效果44。载体递送法是目前研究和应用最的的 siRNA 递送。运用载体运送主要有二种：a）将 siR