Cre_Loxp系统的应用及进展

1、作者简介 :任荣荣 (1981.11-, 女 , 硕士。研究方向 :电压门控性钠离子通道 1亚基在神经病理性疼痛中的 作用。*通讯作者 :Tel :021 65790000, E mail :wangyingwei ·综述 ·Cre/Loxp系统的应用及进展任荣荣 综述 王英伟 审校(上海交通大学医学院附属新华医院麻醉科, 上海 200092关键词 Cre 重组酶; Loxp 位点; 转基因技术; Cre/Loxp系统中图分类号 Q812文献标识码:A 文章编号:1008 1836(2008 02 0078 03随着分子生物学的迅猛发展, 转基因技术发挥 着越来越重要的作用

2、, 已经渗透到人类生活的各个 领域。所谓转基因技术就是将人工分离和修饰过的 基因导入到生物体基因组中, 由于导入基因的表达 从而引起生物体性状可遗传的修饰。转基因技术推 动了从分子水平了解生命现象、 探讨生命本质、 研究 疾病发生机理等方面的发展。国内外在动物转基因 技术方面均已开展了卓有成效的工作。其中小鼠转 基因研究方面成就最大、 发展最为迅速、 应用最为广 泛的就是应用 Cre/Loxp系统对小鼠进行基因的敲 除、 激活、 倒转和易位等。1Cre/Loxp系统的概述Cre/Loxp重组系统策略是进行基因组定点突变 的新途径 1,2。该系统在 80年代被引入后, 已被成功 的应用于酵母菌、

3、 植物、 哺乳动物细胞培养及小鼠身 上。 Cre/Loxp重组系统包括 Cre 重组酶和 Loxp 位点 两个部分, Cre 重组酶由大肠杆菌噬菌体 P1的 Cre 基 因编码, 由 343个氨基酸组成, 它不仅具有催化活 性, 而且跟限制酶相似, 识别特异的 DNA 序列, 如: Loxp 位点, 引起重组。Loxp 位点是 Cre 重组酶作用的特异性重组位 点 , 由 34bp 组 成 , 即 :ATAACTTCGTATAGCATA CATTATACGAAGTTAT , 两个 13bp 的反向重复顺序 和 8bp 的间隔区域构成。 Cre 重组酶有 70%的重组 效率, 不借助任何辅助因子

4、, 作用于多种结构的 DNA 底物, 如线形、 环状, 甚至超螺旋 (被 Cre 重组酶 解螺旋成为线形结构 1,3。 Cre 重组酶通过与 DNA 上 Loxp 位点的结合, 发挥其重组作用 1。 2Cre/Loxp系统的应用Cre/Loxp重组系统可在哺乳类细胞和转基因鼠 中因 Loxp 位点设计的不同而产生特异性重组 4 6。 其应用主要包括基因失活或敲除、 基因激活、 基因颠 换、 基因易位, 还可以利用此系统进行载体的构建。 2.1内、 外源基因失活或敲除相对传统的基因突变技术, Cre/Loxp系统借助 Cre 重组酶表达的特异性, 条件性敲除基因, 大大降 低了小鼠的死亡率。具体

5、分三部分:(1 在胚胎干细胞 (embryonic stem cell , ES cell 中通过置换型载体进行同源重组, 向基因组靶位点 引入选择标记基因, 并在其两侧引入两个同向排列 的 Loxp 位点。两条同源染色体都带有 Loxp 位点且 引入的 Loxp 位点不能干扰靶基因的转录。将该 ES 细胞打入假孕母鼠中, 发育成 “ floxed 小鼠” 。但要 保证 “ floxed 小鼠” 表型要跟野生型小鼠一致。 (2 利用原核注射的方法获得转基因 “ Cre 小 鼠” 。此转基因小鼠在特定的启动子下表达 Cre 重 组酶, 其 Cre 酶的重组效率可以用其他的工具鼠 (如 Rosa2

6、6 检测。(3 “ Cre 小鼠” 跟 “ floxed 小鼠” 交配, Cre 重组酶会 切掉 Loxp 位点之间的靶基因和 1个 Loxp 位点, 从而达 到靶基因的失活或敲除 4 7。 2006年, Berton 等 8利用 上述方法把大鼠脑源性神经营养因子 (brain derived neurotrophic fac tor,BDNF 的局部表达降低, 产生类似 长期服用抗抑郁药的抗抑郁效果, 从而证明了 BDNF 参与到神经环路和行为可塑性的过程中。2.2基因激活利用 Cre/Loxp系统不仅可对基因进行敲除, 还 可对基因进行特定激活, 了解基因的正向效应。在 两个同向 Loxp

7、 位点之间加入终止信号, Loxp 位点后 加入靶基因, 与 Cre 小鼠交配后, Cre 重组酶切除终78第 2期 任荣荣, 等. Cre/Loxp系统的应用及进展止信号及 1个 Loxp 位点, 其 Loxp 位点后面的靶基因 便被 “激活” 表达。 Hnasko 等 9选用多巴胺缺陷的 小鼠, 在表达内源性酪氨酸羟化酶基因的前面加了1个 Loxp pgk neo Loxp , (pgk 为酪氨酸羟化酶的终 止信号, neo 为筛选标记 , 正常情况下, 小鼠表达 pgk , 后面的酪氨酸羟化酶不表达; 在小鼠尾状核注 入 Cre 重组酶的情况下, Cre 重组酶切掉终止信号 pgk 和

8、1个 Loxp 位点, 酪氨酸羟化酶便表达, 尾状核 部位生成多巴胺, 从而研究神经递质多巴胺在这个 部位的功能。2.3基因插入采用同源重组技术, 在基因组上人工构建两个 Loxp 位点, 借助构建的两个 Loxp 位点, 把两端带有 Loxp 位点的外源基因重组到基因组上, 此种重组是 双向的, 既可以把外源基因重组到小鼠基因组内, 也 可把小鼠基因组内源基因重组出来, 这是定点整合 的重要手段之一。2.4基因倒转在同一染色体上构建两个相反的 Loxp 位点, 在 Cre 重组酶的作用下, Loxp 位点之间的靶基因反方 向倒转。2.5基因易位在不同染色体上分别构建 1个 Loxp 位点,

9、在 Cre 重组酶的作用下, Loxp 位点后面的基因发生重组, 不同染色体上大片段基因互相交换, 染色体易位。 Testa 等 10利用此原理进行了如下操作:首先, 利用 同源重组的方法在 13号染色体 DEK 基因的内含子 加入 Loxp 位点及筛选标记 hygro (潮霉素 ; 其次, 利 用同样的方法在二号染色体 CAN 基因的内含子加 入筛选标记 neo (新霉素 及 Loxp 位点; 最后, 在 Cre 重组酶的作用下, DEK 基因片段与 CAN 基因片段交 换, 产生 DEK CAN 融合基因, 实现基因易位。 3Cre/loxp系统的新进展80年代 Cre/Loxp系统的时间

10、与空间的控制依赖 于 Cre 的启动子, 现在发展为依赖于受体与配体的 结合来实现其时间、 空间的控制。目前, 可从两个水平进行调控, 即:转录水平和 翻译后水平。转录水平的调控以四环素 (抑制 控制 系统为例 11:在没有四环素的情况下, 转录激活蛋 白与转录激活蛋白基因相结合, 激活后面 Cre 重组 酶的表达; 在四环素存在的情况下, 四环素与转录激 活蛋白相结合, 使其不能结合转录激活蛋白基因, 从而达到了抑制的目的。翻译后水平以雌激素系统为 例:2007年, Bradley 等 12在 scl 基因的启动子或加 强子 0.9E3后面加上 1个 Cre er (er 表达雌激素他莫 西

11、酚的受体 的基因, Cre 基因就可以按照 scl 基因的 表达方式表达, 从而得到 “ Cre er 工具小鼠” 。在正 常情况下 “ Cre er 工具小鼠” 不表达 Cre 重组酶, 使用 雌激素他莫昔酚 (tamoxifen 诱导才能表达 Cre 重组 酶。这只 scl Cre er 小鼠可以与其他的 “ Loxp 小鼠” 进行交配, 交配的后代可以在特定时间注入雌激素tamoxifen , 与雌激素受体结合后, 表达 Cre 酶, 就可以 对后代小鼠的 Loxp 位点进行重组。为了避免体内 雌激素的干扰, 可对雌激素受体基因的配体结合区 做一定程度的改变, 使其只能和某些雌激素衍生物

12、 相结合, 确保条件重组的特异性。现在不仅用 Cre/Loxp系统进行基因的失活或敲 除、 基因激活、 基因颠换、 基因易位, 还可以用其构建 高效表达的载体。 2007年, 王文棋等 13利用此系统 构 建 了 1个 高 效 表 达 绿 色 荧 光 蛋 白(Green fluorescent protein , GFP 的载体。在 Cre 酶的作用 下, 把 gfp 基因先从基因供体 pTLG 上切下来, 然后通 过重组把 gfp 整合到基因受体 pET Loxp 受体上, 完 成 gfp 基因高效表达载体 pET gfp 的构建, 从而使繁 琐的传统载体构建变为简单的酶促反应, 极大地简

13、化了载体构建步骤, 免去为构建载体选择酶切位点 的繁琐, 为 Cre 酶在基因克隆和亚克隆中的应用提 供了很好的研究基础。利用 Cre/Loxp系统进行遗传操作具有显著的优 势, 许多学者对此已进行了大量的研究工作, 此系统 被广泛应用于小鼠的转基因研究中。 Cre/Loxp系统 短小精悍、 Cre 酶作用专一, 且不影响基因的正常表 达与调控, 该系统的应用为转基因技术开辟出一条 崭新的道路。参考文献1Trinh KR , Morrison SL. Site specific and directional gene replacement mediated by Cre recombina

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