基因芯片技术在作物中的研究进展及展望

1、第28卷 第1期Vol 28,No 1江 西 棉 花JI ANGXI C OTTON2006年2月Feb ,2006专题综述基因芯片技术在作物中的研究进展及展望张志刚,杨晓萍,梅正鼎,刘开智(湖南省棉花科学研究所,湖南 常德 415101摘要:简要地概述了基因芯片技术的技术原理与设计理论,并从寻找新基因、基因组测序、基因表达水平检测、后基因组学研究、转基因农产品检测等方面介绍了国内基因芯片技术的研究进展,同时对我国基因芯片研究应用前景进行了展望。关键词:基因芯片;作物;DNA中图分类号:S562 035 2 文献标识码:A 文章编号:1006-0499(200601-0003-03基因芯片是应

2、后基因组时代大规模基因功能研究的需要而产生的高新生物技术,具有过程连续化、集成化、微型化、自动化、高通量、高度平行性等特点。为研究来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激(包括不同诱导、不同治疗阶段下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA 与表达谱芯片进行杂交,可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析与判断,研究基因功能以及进一步研究基因间相互作用的关系。因此,基因谱芯片可以获得大量与研究领域相关的基因,从而使科研更具有目的性和系统性,同时也拓宽了研究领域。1 基因芯片技术

3、1 1 基因芯片的概念及原理基因芯片,又称DNA微阵列,是指固着在载体上的高密度DNA微点阵。具体地说指将大量(通常点阵密度高于400/cm2基因探针分子固定于载体(玻片或薄膜后与标记的样品分子(mNRA、cDNA、基因组DNA等进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子数量和序列信息。根据储存的生物信息的类型,基因芯片大致可分为寡核苷酸芯片、cDNA芯片和基因组DNA芯片三大类。按制备方法可以分为两种:一种是寡核苷酸微阵列,这种方式是以光蚀刻技术与固相化学相结合的方法在体表面直接合成探针,形成致密、有序的DNA分子点阵;另一种是DNA微阵列,这种方法是将纯化的DNA样品固着

4、于常规纤维素膜或玻片的表面,形成致密DNA微集阵列。基因芯片技术是一种高通量对样品序列进行检测和分析的方法,这种方法解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等问题。1 2 基因芯片的研究技术和设计理论基因芯片的设计理论一是根据基因芯片的分析目标,从相关基因数据库中选取特异性基因序列,使之能够通过与靶基因杂交给出明确、可靠,易于分析的分子以及分子之间的信息;二是根据所选用的核酸序列进行探针序列及其布局设计,使所设计的探针组合对靶基因的杂交特异性强,探针之间的关联性好。即使在杂交过程中产生个别的错配,通过对杂交阵列信息进行全面综合的分析,也可获得正确的信息;三是

5、探针及其空间布局的优化,包括探针制备工艺的优化和探针杂交的优化等诸多方面。因此,基因芯片的研究技术包括四部分:基因资料库以及载有基因片段的细菌库、基因芯片点样系统、样品标记及杂交、信号获得及数据分析系统。具体过程包括:从样品中分离RNA,准备靶DNA,样品与基因芯片探针的杂交,数据采集和生物信息的分析。3收稿日期:2005-11-072 基因芯片应用进展分析2 1 寻找新基因,并推测一些已知基因的功能在植物上构建cDNA文库,对正常和逆境条件下或野生型与突变体进行杂交筛选,就可以找出差异表达序列。以差异序列设计探针可以从文库中调出相应的克隆,经测序鉴定就可以确定是否为新基因。Aharoni A

6、等从草莓中分离了1701个cDNA片段,与480个矮牵牛植物克隆做对照,构建成微阵列芯片来研究草莓果的不同成熟时期果色与成熟度的关系并证实有两个基因是新基因,草莓乙酰基转移酶基因是其中之一。Guteraman A等也利用DNA芯片从玫瑰花有气味和没有气味的四倍体栽培植株中鉴定了新的与香味相关的基因。Seki M et al利用各种发育时期,经不同处理(干旱、冷害及未经胁迫处理的拟南芥构建cDNA文库,从中得到了1300个全长的cDNA,并制作成cDNA芯片,与特异探针进行杂交,结果1300种cDNA中有44种是受干早诱导,19种受冷害诱导,其中30种和10种是从未报道过的胁迫诱导基因,并且12

7、种胁迫诱导基因被鉴定为受DREB1调控的靶基因,其中6个是未报道过的新基因14。2 2 基因组测序基因芯片技术用于序列分析提出最早,原理是依据短的标记寡核苷探针与靶DNA杂交,利用杂交谱重建靶DNA序列。它可一次测定较长的DNA序列,Bevan M等对拟南芥第4染色体上的1 9Mb片段进行了全序列测定,结果发现拟南芥基因组中平均每4 8Kb就有一个基因存在,而且54%的基因与GenBank中已知功能的基因有同源性,56%的基因可以与GenBank中的EST相对应,大约20%的基因在该染色体片段上以基因家族的形式存在。另外,在该染色体片段中共发现5种重复成分:非编码区中的重复DNA序列、反逆转座

8、子成分、叶绿体DNA片段、散布重复的基因家族成员,以及串联重复的基因家族成员,这些重复成分约占所测序列的19%左右。植物基因组序列的测定,将有助于了解基因表达模式、基因突变和多态性,发现新基因以及克隆特异性基因,也将促进植物功能基因组的研究。2 3 基因表达水平检测用于基因表达水平检测的方法很多,有Northern杂交、Real-time PCR、mRNA差异显示法、cDNA代表性差异分析等方法。DNA芯片技术应用于基因表达水平的检测的最大优越性是可自动、快速、平行检测目的材料中成千上万个基因的表达情况。Schenaetal采用拟南芥基因组共45个基因的cDNA微阵列(其中14个为完全序列,3

9、1个为EST检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平。结果表明,发现该植物根和叶组织中存在26个基因表达的差异,而参与叶绿素合成的C AB1基因在叶组织较根组织有高达500倍的表达。Wang Yh等利用微阵列研究了西红柿根在矿质条件变化时基因表达的变化,Ha mmond JP等研究了拟南芥磷饥饿状态下根和叶中基因组表达的明显改变,Yu LX等研究了水胁迫下发育的玉米谷粒中胚乳和胎座/花梗组织的转录分布图,Michae L等研究了拟南芥在整个生理周期中特定基因转录呈现的规律性变化。Schaffer等使用了含有11521个拟南芥表达序列标签的微阵列来鉴定1d内每隔6h基因表达水平的变化。11%的

10、基因具有高水平和低水平循环型表达,同时鉴定了只被生物钟调控的基因群体。同时,植物在不同的环境条件下表达的基因是不同的,而顺式作用因子和反式作用元件的相互作用是基因表达体调控的重要方式。通过基因芯片技术可以对逆境诱导下产生的反式作用因子的基因进行研究,对于全序列测序已经完成的植物,还可以通过其基因组与全长c DNA的对比得到的信息研究逆境诱导的基因的启动子。Shinozaki等用拟南芥7000个全长cDNA的微阵列研究与干旱、低温、高盐、AB A等逆境对植物基因表达的影响,结果发现其中有22个转录因子基因受AB A诱导表达,这表示在AB A的信号转导途径中存在许多信号调节机制;另外,在53个冷诱

11、导的基因中获得了41个基因的启动子序列,其中的9个基因的启动子序列不包括DRE或DRE核心序列的元件,暗示存在新的顺式作用元件参与冷诱导基因的表达36。2 4 利用基因芯片技术进行后基因组学研究基因预报和功能鉴定是测序和对基因组进行注释的结果,基因组测序完成后,研究未知基因的功能是一个十分诱人的后基因组研究课题。Standford大学的Davis研究小组利用DNA芯片对酵母缺失突变株进行定量分析以确定酵母全序列完成后新发现的ORF的生物学功能。应用基因打靶技术产生许多个ORF缺失突变株酵母,并在缺失ORF旁侧引入20个核苷酸的标志序列作为缺失ORF的身份标志,即所谓的 分子条形码 。分子条形码

12、可4与DNA芯片上的探针杂交,以便于筛选。这样ORF功能测试可通过一次杂交及用同一生长培养条件完成,大大提高了效率和准确性。说明作物基因组中未知功能的ORF可用DNA芯片来探明,这在作物育种上具有重大应用价值5。2 5 转基因农产品检测广泛收集用于转基因技术的启动子、目的基因(如抗病基因、抗虫基因等和标记基因的EST序列,制成基因芯片,可以对转基因农产品进行检测。Suzuki M等使用寡聚核苷酸微阵列分析了携带35S:VP1的拟南芥转基因植株。用基因芯片分析鉴定了353个VP1/AB A调控的基因。这些基因中的73%在植物组织中受VP1和AB A的影响,这显示了AB A信号传导和VP1功能之间

13、的紧密联系。Abe H等报道了r d22启动子区域MYC和MYB识别位点在干旱诱导的r d22基因的表达中是作为顺式作用元件发挥功能的。Sinvany-Villalobo G等利用70-mer的寡核苷酸微阵列研究了拟南芥线粒体和叶绿体中多基因家族成员在不同的生长条件刺激下的转录变化情况7。3 基因芯片的发展分析基因芯片技术是一门新兴的技术,其方法仍有待于进一步发展,现在还没有建立统一的标准,实验设计等方面还存在许多问题。检测低丰度RNA转录本的敏感性和如何确定在不同条件下的适当标准是基因芯片要解决的首要问题,基因芯片发展的一个重要目标是将生命科学研究中样品的制备、生物化学反应、检测和分析的全过

14、程,通过采用微细加工技术,集成在一个芯片上进行,构成所谓的微型全分析系统,或成为在芯片上的实验室,实现分析过程的全自动化。基因芯片发展方向包括以下几个方面:第一,现在cDNA芯片需要大量的RNA(l0ug总RNA或5OOng的mRNA,因此必需改进RNA的扩增方法以分析更小量的RNA,最终进行单细胞表达分析;第二,需发明新的更敏感的信号检测系统;第三,芯片制备、样品处理、杂交、检测以及数据分析的标准化,提高基因芯片的准确性和可靠性。尽管基因芯片技术还存在很多问题,但由于其具有并行化和高通量的特点,它的应用前景仍十分广阔。最近几年,基因芯片技术有了很大的进展,目前该技术对样品的需要量非常少,效率

15、高,能同时分析数千种作为遗传、基因组研究或诊断用的DNA序列,更好地解释基因之间表达的相互关系及检测基因表达变化的灵敏度高等优点。基因芯片技术在植物上的应用前景无疑是非常广阔的,如对基因功能、植物生理机制、农业发展、农业食品卫生、环境污染监测的研究与探讨等方面。参考文献1赵奂,赵晓刚,何奕昆,等 表达序列标签及基因芯片技术在植物抗性基因研究中的应用J 生物信息学,2004,2:9122李淼,檀根甲,周冬生,等 基因芯片技术及其在植物病害研究中的应用J 植物保护,2003,29(1:1593洪丽亚,黄儒珠 基因芯片技术及其在植物上的应用J 生物技术通报,2002(4:30354许志茹,李玉花 基

16、因芯片技术在植物研究中的应用J 生物技术,2004,14(6:70725郭新红,姜孝成,潘晓玲,等 基因芯片技术与基因表达谱研究J 生物学杂志2001,18(5:126李喜焕,王省芬,穆国俊 基因芯片技术及其在植物育种上的应用J 河北农业科学,2003,7(2:44497徐景升,张木清,陈如凯 基因芯片技术及其在农业上的应用J 福建农林大学学报,2002,31(1:266Research Progress and prospects of using genepermutation technique in cropsZ HANG Zhi-gang,YANG Xiao-ping,MEI Zheng-ding,LIU Kai-zhi(Hunan province cotton science researc h ins ti tute ,Changde415101,ChinaAbstract:This article summarized technique principle and design theory of gene per mutation technique.It also interduced chinese gene permutation technique research p