PCR扩增检测乙肝病毒

1、实验三：实验三：PCR扩增检测乙肝病毒扩增检测乙肝病毒 乙肝病毒（乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，）感染引起的乙型肝炎，我国发病率很高我国发病率很高 ，HBV的检测极其重要。的检测极其重要。 HBV DNA存在就可以引起乙肝的传染，乙存在就可以引起乙肝的传染，乙肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒复肝病毒基因是乙肝病毒的核心成分，是病毒复制的发动机制的发动机 。 PCR技术可以检测出极微量的病毒，是判技术可以检测出极微量的病毒，是判断其传染性最直接、最可靠的证据。断其传染性最直接、最可靠的证据。PCR技术技术已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观察已成为公认的对病毒性肝炎的诊断、疗效观

2、察及预防研究工作最理想的方法之一。及预防研究工作最理想的方法之一。一、实验目的一、实验目的1.掌握掌握PCR技术扩增的原理技术扩增的原理2.熟悉熟悉PCR扩增检测乙肝病毒的基本操作扩增检测乙肝病毒的基本操作过程。过程。二、实验原理二、实验原理 聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction) 简称简称PCR,是在体外条件下利是在体外条件下利用用DNA聚合酶、催化一对引物间的特聚合酶、催化一对引物间的特异性异性DNA片段合成的基因体外扩增技片段合成的基因体外扩增技术，它包括三个基本过程：术，它包括三个基本过程：1.变性：变性：加热加热使双链使双链DNA变为单链变为单

3、链2.退火：退火：急速降温急速降温使引物和互补模板使引物和互补模板 在局部形成杂交链在局部形成杂交链 3.延伸：耐热延伸：耐热DNA聚合酶按聚合酶按5 3 方向催化以引物为起始点的方向催化以引物为起始点的 延伸反应延伸反应模板模板DNA高温变性高温变性低温退火低温退火引物引物适温延伸适温延伸经过经过25-35次循环后，目的片段扩增次循环后，目的片段扩增2n倍倍两条子代两条子代DNA一一次次循循环环Tap酶酶5335353555三、主要器材及试剂三、主要器材及试剂1.主要器材：主要器材：9700型型PCR仪仪电泳槽、电泳仪电泳槽、电泳仪 紫外分析仪紫外分析仪台式高速离心机台式高速离心机2.主要主

4、要试剂试剂：HBV-PCR定性检测试剂盒定性检测试剂盒PCR反应管反应管HBV阳性标本阳性标本DNA提取液提取液四、操作步骤四、操作步骤1.标本处理：取患者血清标本处理：取患者血清40l，加入，加入DNA提取液提取液40l，沸水浴，沸水浴10分钟，分钟，10000转离心转离心5分钟，取上清液分钟，取上清液4l做做PCR反应。反应。2.加样：加样：加入提取好的标本加入提取好的标本4l，6000转离心转离心10秒。秒。 取试剂盒中取试剂盒中PCR反应管反应管 TapDNA聚合酶聚合酶10扩增缓冲液扩增缓冲液 4种种dNTP混合物混合物引引 物物(小分子小分子DNA片段片段） Mg2+ 三个扩增步骤

5、温度及时间扩增步骤温度及时间 温度温度 时间时间变性变性 93 45（首次（首次5）退火退火 55 45延伸延伸 72 60（末次（末次5）循环次数：循环次数：25次次 3.PCR仪上扩增：仪上扩增：PCR仪上扩增仪上扩增加入标本加入标本离心离心6000转离心转离心10秒秒4.电泳检测：电泳检测：制备制备2%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 2%琼脂糖的制备：琼脂糖的制备：电泳槽的准备：电泳槽的准备：称取称取0.8g琼琼脂糖脂糖40mlTBE电泳缓冲液电泳缓冲液（PH8.0)煮沸溶解煮沸溶解加入加入冷却冷却60左右左右加入加入溴乙啶溴乙啶EB25l倒胶倒胶加样：取扩增后的产物加样：取扩增后的产物10 ul点样于凝胶孔点样于凝胶孔取样取样点样点样电泳：点样端接电泳：点样端接“-”，稳压，稳压，50V，电泳，电泳30分钟。分钟。五、结果观察：紫外分析仪下观察，出现橙黄色五、结果观察：紫外分析仪下观察，出现橙黄色条带则为条带则为HBV阳性阳性HBV阳性阳性HBV阴性阴性HBV阳性对照阳性对照HBV阴性对照阴性对照正极正极负极负极点样孔点样孔五、注意事项五、注意事项1. 试剂盒内阳性标本及试剂盒内阳性标本及DNA提取液使用前需充提取液使用前需充分融化离心。分融化离心。2. 反应液的表面为固体封盖剂，电泳取样时从反应液的表面为固体封盖剂，电泳取样时从反应管底