胃铋镁中药组分对胃癌细胞周期的调节和裸鼠体内肿瘤抑制的实验研究_0000

1、纳米氧化铋镁对胃癌细胞(或肝癌细胞)周期的调节和裸鼠体内肿瘤抑制的实验研究武志富(1.;2.)摘要目的 研究胃铋镁中药组分(弗朗鼠李皮茴香石菖蒲甘草和芦荟)对胃癌细胞周期的调节作用和对胃癌移植瘤的生长抑制作用 方法 将胃铋镁和胃铋镁中药总组分及其组分中弗朗鼠李皮茴香石菖蒲甘草芦荟分别作用于胃癌细胞SGC一7901,MTF法检测各处理组细胞的增殖状态;流式细胞仪检测细胞周期;Wester nblot检测细胞周期相关蛋白的表达 构建裸鼠SGC一7901胃癌移植瘤模型,研究胃铋镁及其中药总组分及其组分对胃癌移植瘤的生长抑制作用;免疫组化检测STAT3信号通路相关蛋白STAT3P-STAT3Bcl-2

2、CyclinDI和Survivin的表达情况 结果 胃铋镁中药总组分及其组分中的弗朗鼠李皮茴香和石菖蒲对SGC.7901细胞的抑制率显著高于对照组(P<0.05);流式检测和Westernblot结果显示,胃铋镁胃铋镁中药总组分及其组分中弗朗鼠李皮茴香和石菖蒲均可以使胃癌细胞阻滞于G1期 (P<0.05),并能够有效下调细胞周期蛋白CyclinABDE的表达;但甘草和芦荟对胃癌细胞的增殖抑制和细胞周期阻滞作用不显著 荷瘤裸鼠实验结果显示,胃铋镁中药总组分组弗朗鼠李皮组茴香组和石菖蒲组对胃癌细胞的生长抑制作用显著强于对照组和三联药 (三种市售胃炎胃溃疡类药物联合用药)组 (P<

3、0.05),并可以抑制 STAT3的磷酸化,下调 STAT3信号通路靶基因Bcl-2CyclinD1和 Survivin的表达 结论 胃铋镁及其中药组分中的弗朗鼠李皮茴香和石菖蒲可以显著抑制胃癌细胞SGC-7901增殖,阻滞细胞周期于G1期,并可以在体内抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长关键词胃铋镁;中药组分;胃癌;细胞周期中图分类号 R735.2 文献标识码 AEfectsofChinesemedicineportionsofWeibimeioncellcycleregulationand tumorinhibitioninnudemiceQIAOWei”,DIJun升,WANGXiaowan,DONG

4、Xu,ZHANGQi,JIANGChun.wa,LIJiang弘 LIXiao.meng(1.KeyLaboratoryofMolecularEpigeneticsofMOE,SchoolofLifeSciences,NortheastNormalUniversity,Changchun130024,China;2.DepartmentofPathology, PeopleSHospitalofJilinProvince,Changchun130000,China; 3.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,StomatologicHospital,J

5、ilinUniversity,Changchun130041,China)Abstract ObjectiveTostudytheeffectsofWeibmieianditsChinesemedicineportions(coriexfrangulae, fennelpowder,acorllstatarinowii,glycyrrhizaeandasparagus)oncellcycleregulationingastriccancercellsandgrowthinhibitioningastriccancerXenografts.MethodsGastriccancerSGC-7901

6、cellswerenormallyculturedandtreatedwithWeibimei, extractumglycyrrhizae,cortexfrangulae, fennelpowder,acorustatarinowiiandasparagus.Then,theproliferationofSGC-7901cellsweredetectedbyM1Trassay,theireffectonSGC-7901cellcycleweremeasuredbyflowcytometry,andtheexpressionofcellcyclerelated proteinswereexam

7、inedbyWesternblot.AnimalmodelsofSGC-7901cellsxenograftsinnudemicewereconstructedtoevaluatethegrowthinhibitioneffectsofWeibimeianditsChinesemedicineportions,andtheexpressionofSTAT3,pSTArI3,CyclinD1,Bc1.2andSurviviningastrictumorsweredetectedbyimmunohistochemicalassays.ResultsWeibimeianditsthreekindso

8、fChinesemedicineportions.资助项目:科技部国际合作项目 (2010DFA31430J;吉林省科技厅 (20130521010JH,20150101187JC20150414007GH),吉林省教育厅课题(2015526,2015551);高校基本科研业务费专项基金 (2412015ZH005,2412016KJ037,130017507,130028633);吉林省高等学校经济菌物高端科技创新平台I吉高平合字 【2014】B1);国家自然科学基金(30871301.30700827);引智计划(B07017)一作者简介:乔巍,女,硕士在读研究方向:肿瘤信号转导,E.ma

9、il:.ca;邸军,共同第一作者,男,主任医师,研究方向:肿瘤信号转导,Email:Dijun1991163.COB;李晓萌,通信作者,女,教授,博士生导师,研究方向:肿瘤信号转导,Email:.an;李江共同通信作者,男教授,硕士生导师,研究方向:肿瘤信号转导,E-mail: . ca特约论文中国生化药物杂志 2016年第6期 总第36卷26cortexfrangulae. fennelandacorustatarinowiicouldobviouslyinhibittheproliferationofS

10、GC-7901cells, compared tocontrolgroup,withastatisticalsignificantdiference (P<0.05).ThecellcycleofSGC-7901wasarrestedatG1phasewithcodexfrangulae, fennelandacorustatarinowiitreatment,theexpressionofCyclinA,B, D,Eweredecreasedsignificantly (P<0.05).However,nosignificanteffectswasfoundinglycyrrhi

11、zaeorasparagusgroup.XenograftstumorsizesinWeibimei, cortexfrangulae, fenneloracorustatarinowigroupsweremuchsmallerthanthatinsalinegrouporTripleTherapygroup (threekindsdrugscombinationforthetreatmentofgastriculcer) (P<0.05).XenograftsexperimentsshowedthatthetumorgrowthinnudemiceinWeibimei, cotrexf

12、ranuglae,nneloracorustatarinowigroupsweresignificantly smallerthanthatincontrolgrouporinTirpleTherapyGroup (P<0.05),andphosphorylatedSTAT3, andSTAT3signalingtargetedgenes, includingBcl-2,CyclinD1andSurvivinwereallsignificantlydownregulatedbyimmunostaining.ConclusionWeibimeianditsChinesemedicinepo

13、trionsincludingcodexfrangulae,fennelandacorustatarinowiicancouldsignificantlyinhibitthegrowthofSGC-7901cellsproliferationandarrestedthecellcycleofG1phase invitro, and inhibitgastriccancerxenograftsinnudemiceinvivo.KeywordsWeibmiei; chinesemedicineportion; gastriccancer; cellcycle胃癌是全世界最常见的消化道肿瘤之一,已成

14、为我国第二大致死癌症,目前尚无有效的治疗药物 胃铋镁颗粒属新型化药中药结合制剂,对临床上各种胃炎胃溃疡和胃黏膜损伤均有很好的疗效 J 在前期研究中,本课题组通过体外细胞实验发现胃铋镁在体外可以显著抑制胃癌细胞SGC-7901增殖,促进细胞凋亡,作用效果主要来自胃铋镁一中药总组分,而胃铋镁一化药总组分抗肿瘤作用不显著 (正在投稿) 胃铋镁中药组方由甘草浸膏粉弗朗鼠李皮茴香粉石菖蒲和芦荟 5种单药组成,每种单药组分作用不同,抗肿瘤的具体有效单药和机制尚不明确本实验旨在探讨胃铋镁及其中药组分对胃癌细胞株SGC-7901增殖和细胞周期的影响,及其在体内抑制胃癌生长的效应,为开发低毒高效的抗肿瘤药物提供

15、实验依据1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞和实验动物:胃癌SGC-7901细胞系由本实验室保存;24只体质量2025g的6周龄BALB/c裸鼠购自吉林大学实验动物中心1.1.2 试剂:DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自美国GIBCO公司;MTY购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;胃铋镁药物及其各组分由弘美制药中国有限公司提供;三联药:克拉霉素片购 自上海雅培制药有限公司;阿莫西林胶囊购 自联邦制药股份有限公司;埃索美拉唑镁肠溶片购 自阿斯利康制药有限公司鼠源B-Actin抗体购自武汉博士德兔源STAT3一抗P.STAT3一抗CyclinACyclinBCyclinD1CyclinE一

16、抗survivin抗,鼠源 Bcl一2一抗等均购自SantaCruz,辣根过氧化物酶一(HRP)标记的羊抗兔及羊抗鼠 IgG二抗购自Sigma公司1.1.3 实验仪器:酶标仪(ELx808,美国Bio.Tek公司);流式细胞仪 (EPICSELITEESP);CO2恒温细胞培养箱 (Heracell150,Heraeus,Germany);荧光显微镜 (Olympus,Japan);电泳仪(JM一250,大连捷迈科贸有限公司);电转槽 (Biorad)1.2 方法1.2.1 药物浓度设定:药物浓度根据说明书定量,将如下浓度作为体外细胞实验药物处理的标准浓度,分别是 胃铋镁100g/mL,胃铋镁

17、中药总组分71.4g/mL,中药单药组分包括甘草8.3g/mL弗朗鼠李皮0.5 g/mL茴香0.5g/mL芦荟g/mL石菖蒲0.4 g/mL将如下浓度作为体内裸鼠移植瘤实验药物灌 胃浓度,分别是三联药组(克拉霉素片33.2mg/kg+阿莫西林胶囊101.7mg/kg+埃索美拉唑镁肠溶片 1.8mg/kg)胃铋镁组(1849.5mg/kg)弗朗鼠李皮组(9.2mg/kg)茴香组 (9.2mg/kg)和石菖蒲组(7.7mg/kg)1.2.2 细胞培养和分组:将SGC-790l细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,培养条件为 5%CO2,温度为37 细胞长满后胰酶消化传代,取对数生长期的

18、细胞分成7组,分别用 1.2.1下所述浓度的胃铋镁胃铋镁中药总组分弗朗鼠李皮茴香石菖蒲甘草和芦荟处理,继续培养24h1.2.3 MTF实验:利用0.25%胰蛋白酶消化胃癌SGC7901细胞,以每孔1×104cells接种于96孔板 中,5% CO2,37孵箱培养参照1.2.1,以标准加药浓度(1倍剂量)的1/3浓度作为低浓度,3倍浓度作为高浓度,各种药物分组参照 1.2.2,每组均采用3个浓度作用于胃癌 SGC-7901细胞,24h后每孔加入MTT溶液(5g/L)2OL,继续孵育4h,吸弃孑L内培养上清液,每孔加入 150L DMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解 酶标仪在490

19、nm处测吸光度值(OD)实验重复3次1.2.4 细胞周期实验:胃癌SGC7901细胞以每孔1x106cells接种于6孔板中,5% CO2,37培养,第2天细胞更换成1%FBS的DMEM培养,细胞分组处理和药物浓度参照1.2.2,作用24h后胰酶消化离心收集并悬于PBS中,70%乙醇固定30min,用含RNase及碘化丙锭的染色液避光孵育 30min,流式细胞仪测定细胞周期,用 MULTICYCLE软件处理结果1.2.5 Westernblot实验:按照1.2.2分组和药物浓度处理细胞24h后,RIPA消化提取蛋白质,并配置成相同浓度的蛋白质溶液配置12%分离胶和5%浓缩胶,调整电压80120

20、V电泳2h,300mA恒定电流转膜4h,室温牛奶封闭1h,加一抗(CclinA,CyclinB,CyclinD1,CyclinE,STAT3,PSTAT3,survivin,Bcl一2,稀释比例均为l:200)4孵育过夜,TBST洗涤3次,每次5min加入二抗辣(根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG及羊抗鼠IgG,稀释比例为1:500)室温反应1h,TBST洗涤3次,每次10min最后进行化学发光反应曝光灰度值分析实验重复3次1.2.6 胃癌移植瘤模型实验:SGC-7901细胞经过胰酶消化,离心后用PBS悬起,使细胞浓度为1×10个/mL,接种于裸鼠背部皮下,每只接种0.15mL细胞悬液接

21、种后 10d左右可见背部长出肿瘤块,证明接种成功将肿瘤接种成功的24只裸鼠随机分成 6组,生理盐水组三联药组 (克拉霉素片 +阿莫西林胶囊+埃索美拉唑镁肠溶片)胃铋镁组弗朗鼠李皮组茴香中国生化药物杂志 2016年第6期 总第36卷特约论文P<0.05,”P<0.01,与对照组比较,comparedwithcontrolgroup及其单组分弗朗鼠李皮茴香和石菖蒲能阻滞 SGC-7901细胞周期在G1期,与流式细胞实验结果一致2.2 胃铋镁及其中药组分对胃癌SGC-7901细胞周期的影响 流式结果显示:与对照组比较,胃铋镁和其中药总组分G1期细胞明显增多 (P<0.05),S期和

22、G2期百分比减少 (P<0.05);胃铋镁中药组分中的弗朗鼠李皮茴香和石菖蒲组处在G1期细胞数量也显著增多(P<0.05)见表2说明胃铋镁及其中药组分弗朗鼠李皮茴香和石菖蒲能将 SGC-7901细胞阻滞在G1期.CyclinACylinB1表2 胃铋镁及其中药组分对SGC-7901细胞周期的影响(x±s,n=3)Tab.2 EfectofWeibimeianditsChinesemedicineportiononCyclinD1SGC-7901cellcycle(±, =3)CydinD2Cyclni E13-actin图1 胃铋镁中药组分及其单组分对胃癌细胞周

23、期蛋白表达的影响Fig.1 EfectofWeihimeinaditsChinesemedicineportionontheproteinexpressionrelatedtocellcycleinSGC-7901cellP<0.05,与对照组比较,comparedwithcontrolgroup2.3 胃铋镁中药总组分及各组分对细胞周期相关蛋白表达的影响 Westem结果显示:与对照组相比,胃铋镁中药总组分及单组分弗朗鼠李皮茴香石菖蒲均可以使细胞周期蛋 白CyclinABDE的表达水平下调,见图1说明胃铋镁中药组分2.4 胃铋镁中药各组分对胃癌移植瘤的生长抑制作用选取体外细胞实验中增殖

24、抑制作用显著的药物胃铋镁中药总组分单组分弗朗鼠李皮茴香石菖蒲作为实验组,生理盐水和三联药作为对照组,对移植瘤小鼠进行灌胃治疗结果显示:24d27一组石菖蒲组,每组4只各组均采用灌胃给药,每次给药体积2mL,连续给药3w每4d测量一次肿瘤大小,用游标卡尺测量移植瘤的长径(a)和与之垂直的短径(b),计算肿瘤体积 (V:a×b2/2),绘制肿瘤生长曲线 第 26天处死小鼠,剖肿瘤照相 ,称取肿瘤质量并计算抑瘤率抑瘤率=模( 型组平均瘤质量一给药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量1.2.7 免疫组化实验:用4%的多聚甲醛固定肿瘤组织,石蜡包埋,常规切片 65烤片,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,抗

25、原修复,3%H:02孵育10min,PBS冲洗后进行免疫组化染色适当比例滴加一抗 (STAT3,一STAT3,CyelinD1,survivin,Bcl-2,稀释比例均为1:200),4oC孵育过夜,PBS冲洗3次滴加辣根过氧化物酶标记的二抗,37孵育 1h,PBS冲洗3次然后滴加现配制的DAB显色,苏木精复染,常规梯度脱水透明干燥封片,荧光显微镜下拍照分析1.3统计学方法 应用SPSS17.0软件和Excel2007进行数据分析,正态计量数据用“x±s”表示,组间两两比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义2 结果2.1 胃铋镁及其各组分对胃癌SGC一7901细胞株增

26、殖的影响 MTY结果显示:与对照组相比,胃铋镁能明显抑制SGC一7901细胞增殖,抑制率达到50%以上,差异具有统计学意义 (P<0.05) 胃铋镁中药总组分,胃铋镁中药组分中弗朗鼠李皮茴香和石菖蒲均能显著抑制 SGC-7901细胞增殖 (P<0.05),但甘草芦荟的细胞增殖抑制效应不显著 表明胃铋镁及其中药组分弗朗鼠李皮茴香和石菖蒲具有肿瘤抑制效应见表1表l 胃铋镁及其中药组分对SGC-7901细胞增殖的影响(x±s,n=4)Tab.1 EfectofWeibimeianditsChinesemedicinepotiononSGC-7901cellproliferati

27、on(±s,n=4)Tah. 3组別(% )1340. 83 i66. 99 1 174. 00 i85. 30 323. 17 i24.82 272.33 iI5.6944i75.1. ii6i1473.50i11 99l).71 i218969 ii0.75·26各分対/J图2 各组標鼠肿癌的生.民曲线( i ,s.n二3 )P<0. 05,” P<0. 01 , !·l时照组tt较Fig 2 Tumorgmwlh ·u·onude mi·e in ea·h pup(ii一=3)P<0.0l1l.”1&

28、#39;<0.0l , ·omp性d with contro1 伊up構三标Mnb. 4组別-STA83. 42 i12.4569. 82土12. 9331.89i 8.72-30.71 +10.0441.79i12. l6-52.53 i13.08-i1峯314847a口口日富BE国a'l'1111.種1lllt分及j'组分对1'1報1l中:1ll1l组111l中 STA13 信号通路相.天蛋1'1表达的影l向( x4001fe prul·in1·i("1 rlal,·1 lo ·TAl

29、1 ·ig·alin1l 11al1way inl田r ti製,ue tal1l-l, W·i1,1川·i or ,l· ·lli·_· ml·1i·i·· l·rli··( x4001特的论文后,与生理盐水组和 =联药组相比,胃 名必镁中药总组分组肿瘤的体积和质量均明显降低,抑瘤率显著高于生理盐水组,差异有统计学意义( P< 0. 05 ) ;弗朗鼠李度组茴香组和石菖蒲组的肿瘤体积和质量也显著小于生理盐水组(P<0.05)见图2和表

30、3 表明胃 名必镁中药总组分 単组分弗朗鼠李皮茴香和石菖蒲在体内具有抑制肿瘤生长的作用 中国生化药物f1·,在, 2016年第6期 总第36卷表3 各组荷增操鼠a中瘤生长精況比较(;i±,.· =3 ) Comparisln olumor si·e in·ud· n·ie· ollholopica11y lranlla·uic can“r·e11 within dilf·renl 炉upsliis,l=3肺癌電量l mg)生理盐水组联药组胃 船钱 中药.通t组分组第期鼠事度组蘭番组石富

31、構组f'<0. 05.“/· <0. 01 .与対照组2.5 胃名必t美及1111中i 表达的影响 免疫组化结fij.性组分 錦J期鼠李度面存有T3信号通路相关蛋白水组比较,胃名必镁中可以明显下调 STAT3 信0 4 812 16 时问ld)20 24号通路相美蛋l1蛋胃3的蛋白表达水平,并显著抑制 ' llrl-2Cyclin Dl和Survivin的计学意义(P<0. 05) 地表4和图j'11单组分可在体内抑制 STAT3磷表4 肿瘤组a1中 STA3信1.abel ind·x ollh· pn,lein·

32、;xpresion%l=4)or ti最·u·s(ii%,n=41生理·期1水组1戦.af组胃船機中fif.8组分组先期fi李度组程i存组石 富清组STAT373.82i11.8770.53i15.3729.90i1l.86”25.69i1l. 17”34.69 i10. 8944.67 i13.82·B·1806士18.665, 7.58-24. 86±13. 82-35.63±11.93一“.69i 0.89·Cvclinl)1 Surtivin74.21 i19.0371.03i 8.2835.66 i15.

33、2-32. “ i16, 36-50.65 ·17.5·67.6 i12. 83-· P<0.05. · P<0. 01 11対照ll比较,-l··,l ·STA3 p-SAll hl-2対照 -期l胃 性像中_分S组分组先回R事度组ith ·onl3 讨论肿瘤的发生与细胞增殖和细胞周期异常密切相美,所以药物对肿瘤细胞的增殖抑制和细胞周期的调控是评估药物抗肿瘤疗效的一项重要指标l S71 近年来,采用传统中药治疗胃癌的实验研究取得了很大的进展,大量研究证明中药可通过千扰 DNA 合成,影响细胞周期调控因

34、子的表达,阻滞细胞周期等多种方式抑制胃癌细胞的增殖l8'°1 中药抗肿瘤具有多靶点,不良作用较低,且能提高机体免疫力的特性,越来越受到研究者的重视1'-胃铋l美顯粒属新型化药中药结合制剂,化药组方包括销酸金必 重质碳酸镁和碳酸氢钠,中药组方包括甘草浸青粉弗朗鼠李度茴香粉石菖蒲和芦荟 其中,茴香有减轻胃肠胀气镇痛的作用: ' l ,弗朗鼠李皮具有缓泻促进肠胃蠕动的作用;石菖蒲可促进消化,调节胃肠运动l '41 慢性萎缩性胃炎与胃癌密切关联,胃 名必镁对胃炎的确切疗效和其组方的多样性,提示其单药组方药物可能具有肿瘤杀伤作用 因此筛选胃铋镁的有效单药组分,对

35、胃癌的治疗意义重大 本实验结果表明,胃铋援中药组分中的弗朗鼠李度茴香和28中国生化药物杂志 2016年第6期 总第36卷特约论文9 林樱,舒鹏. 中药诱导胃癌细胞凋亡机制的研究进展J.河北中医,2013,35(5):783-785.1O郑应馨,徐恒卫,崔立新,等.中药治疗胃癌癌前病变的相关药理作用机理J.中华中医药学刊,2007,25(4):716-718.11陈延滨,龚振林,李松.肿瘤的中医治疗原则及中药运用的研究进展J.中医药信息,2002,19 (5):13.12 田静.益气养阴法治疗肺癌初探J.陕西中医,2005,26(4):344.13林楠.小茴香化学成分及药理作用研究现状A/中华中

36、医药学会中药炮制分会 2008年学术研讨会论文集 c.北京,2008:154157.14王睿,费洪新,李晓明,等. 石菖蒲的化学成分及药理作用研究进展J.中华中医药学刊,2013,31(7):16061610.15 KandaN,SenoH,KondaY,eta1.STAT3isconstitutivelyactivatedandsupports cell survival in association with survivin expression ingastriccancercellsJ.Oncogene,2004,4(23):49214929.编( 校:吴茜)约 一一石菖蒲均能够显著抑制胃癌 SGC-7901细胞的增殖;在细胞周期实验中,均能将胃癌细胞阻滞在 G1期,并且下调细胞周期蛋白CyclinABDE的表达,而这些作用在胃铋镁中药组分中的另外两种成分甘草组和芦荟组中不显著 由此可以推断,弗朗鼠李皮茴香和石菖蒲这 3种成分可能是 胃铋镁发挥抗肿瘤作用的主要活性成分 此外,本研究还通过体内胃癌异位肿瘤模型考察