时间分辨荧光技术TRFIA技术课件

1、 时间分辨荧光技术TRFIA技术1时间分辨荧光技术TRFIA技术2标记免疫技术的检测水平标记免疫技术的检测水平 放射免疫放射免疫（精度：（精度：10-12mol/L ） 酶联免疫酶联免疫（精度：（精度：10-9 mol/L ） 化学发光化学发光（精度：（精度：10-15mol/L ） 电化学发光电化学发光（精度：（精度：10-17mol/L ） 时间分辨荧光（精度：时间分辨荧光（精度：10-18mol/L ）时间分辨荧光技术TRFIA技术3放射性免疫分析法（放射性免疫分析法（RIARIA） 放免自放免自60年代问世以年代问世以来对临床诊断起了革来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项命性的贡献，是

2、一项较为成熟的诊断技术。较为成熟的诊断技术。 夹心法、竞争法的标夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测记原理为以后的检测技术的发展奠定了基技术的发展奠定了基础。础。 放射性（放射性（125 I），对环），对环境的污染及对身体的境的污染及对身体的危害危害125125 I 的半衰期短而导的半衰期短而导致其试剂有效期短致其试剂有效期短 被标记物的稳定性差被标记物的稳定性差 操作繁琐，费时操作繁琐，费时 无法保存备用无法保存备用时间分辨荧光技术TRFIA技术4酶免疫分析法（酶免疫分析法（ELISAELISA） 酶免的最大优势在于避酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害免了对环境和人体危害 试剂有效期较

3、长试剂有效期较长 曾经一度被认为是取代曾经一度被认为是取代放免的检测手段放免的检测手段 灵敏度、重复性不及放灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳免，易造成漏检和假阳性性 因酶的纯度和反应过程因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，容易受环境因素影响，导致稳定性不好导致稳定性不好时间分辨荧光技术TRFIA技术5化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法（chemiluminescent immunoassaychemiluminescent immunoassay）单个样本检测速度快，适合做单个样本检测速度快，适合做急诊急诊灵敏度较高灵敏度较高自动化程度高自动化程度高分类：分类： 以丫啶酯直接标记

4、以丫啶酯直接标记 以以HRP标记，鲁米诺为发标记，鲁米诺为发光底物光底物Amerlite系统系统 以以AP(碱性磷酸酶碱性磷酸酶 )为标记为标记物，物，AMPPD为发光底物为发光底物 样品不能重复检测样品不能重复检测 本底较高本底较高 仪器故障率较高仪器故障率较高 试剂稳定性较差试剂稳定性较差 检测精度不高，在超微检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面量分析及早期诊断方面能力不足能力不足 非开放性试剂；试剂价非开放性试剂；试剂价格高格高时间分辨荧光技术TRFIA技术6电化学发光免疫分析法（电化学发光免疫分析法（ECLECL） 80年代末期问世的新型年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法化学发

5、光免疫分析方法 基本原理：根据三联吡基本原理：根据三联吡啶钌啶钌Ru(bpy)3和三丙胺和三丙胺在电场触发下产生发光在电场触发下产生发光的化学发光反应的化学发光反应 本底较小、灵敏度较高、本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽线性范围较宽 以罗氏为代表以罗氏为代表 非开放性试剂系统、不非开放性试剂系统、不能做科研能做科研 试剂价格过高试剂价格过高时间分辨荧光技术TRFIA技术7二、时间分辨荧光技术二、时间分辨荧光技术 （Time-Resolved Fluorescence）时间分辨荧光技术TRFIA技术8时间分辨荧光发展史时间分辨荧光发展史 1979 1979年，年，提出提出“时间分辨荧光免疫分析

6、时间分辨荧光免疫分析”理论，理论，19891989年该技术获诺贝尔化学奖提名。年该技术获诺贝尔化学奖提名。 90 90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。法学研究和临床应用的发展十分迅速。 时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研时间分辨荧光分析技术正在成为现代医学研究中最有发展前景的分析手段究中最有发展前景的分析手段时间分辨荧光技术TRFIA技术9时间分辨免疫荧光技术

7、的定义时间分辨免疫荧光技术的定义 用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质 当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、当反应体系发生后，如抗原抗体免疫反应、核酸探针杂交等反应，经解离核酸探针杂交等反应，经解离增强作用，增强作用，用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强用时间分辨荧光仪，测定最后产物的荧光强度度 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的的时间分辨荧光技术TRFIA技术10

8、TRFTRF分析原理图（分析原理图（1 1）时间分辨荧光技术TRFIA技术11时间分辨荧光技术TRFIA技术12时间分辨荧光技术TRFIA技术13时间分辨荧光技术TRFIA技术14Eu标记物轻链轻链螯合剂螯合剂Eu重链重链时间分辨荧光技术TRFIA技术15时间分辨荧光技术TRFIA技术16时间分辨荧光技术TRFIA技术17时间分辨荧光技术TRFIA技术18仪器检测仪器检测时间分辨荧光技术TRFIA技术19标记物为稀土金属标记物为稀土金属-镧系元素镧系元素 铕铕(Eu)(Eu)、钐（、钐（Sm)Sm)、镝、镝(Dy)(Dy)、锝、锝(Tb)(Tb)镧系元素荧光特点：镧系元素荧光特点： 1 1、荧

9、光寿命极长、荧光寿命极长镧系元素螯合物（镧系元素螯合物（6060900 us) 900 us) 714us普通荧光免疫中荧光团：普通荧光免疫中荧光团：1 1100us100us样本中蛋白质荧光：样本中蛋白质荧光：1 110us10us，易猝灭，易猝灭时间分辨荧光技术TRFIA技术20利用镧系元素荧光物利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后理特性，荧光激发后在固定时间段检测特在固定时间段检测特异性荧光而在此时间异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光之前，非特异性荧光已完全衰减为已完全衰减为0 0TRF分析原理图（分析原理图（2）时间分辨荧光技术TRFIA技术21标记物为稀土金属标记物为稀土金属-镧系

10、元素镧系元素2 2、StokesStokes位移大位移大（大约（大约290nm290nm） 铕：激发光铕：激发光340nm340nm、发射光、发射光613nm613nm 荧光荧光素的素的StokesStokes位移位移为为280nm280nm3 3、荧光特异性强、荧光特异性强（发射光谱带很窄：（发射光谱带很窄：615615 5nm5nm）4 4、解离、解离- -增强技术增强技术可使其荧光性提高可使其荧光性提高100100万万倍倍时间分辨荧光技术TRFIA技术22巨大巨大StokesStokes位移位移发射光谱与激发发射光谱与激发光谱间存在的巨光谱间存在的巨大大StokesStokes位移。位移

11、。可以通过干涉滤可以通过干涉滤光片将发射光谱光片将发射光谱与激发光谱完全与激发光谱完全分离分离时间分辨荧光技术TRFIA技术23TRFIATRFIA为临床检测带来的先进性为临床检测带来的先进性技术技术特点特点检验先进性检验先进性时间分辨时间分辨光谱分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧特异性荧光与非特异性荧光分离光分离发射荧光与激发光分离发射荧光与激发光分离零背景、高特异性零背景、高特异性高灵敏度高灵敏度解离解离-增强增强 荧光性大大提高荧光性大大提高稳定的荧光螯合物稳定的荧光螯合物线性范围宽线性范围宽高灵敏度高灵敏度原子标记原子标记 标记位点多，可达标记位点多，可达20个个 对标记物结构及活性影

12、对标记物结构及活性影响小响小 无衰变无衰变 受环境影响小受环境影响小高稳定性，高精确度高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长标准曲线保留时间长同一批次可两点定标同一批次可两点定标多标记多标记单，双，三，四标记单，双，三，四标记同一试剂盒可同时测同一试剂盒可同时测多个项目多个项目时间分辨荧光技术TRFIA技术24灵敏度更高，检测范围更广灵敏度更高，检测范围更广 以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书 试剂试剂 DELFIA（WALLC） Immulite（DPC化学发光）化学发光） ACS-180(拜拜尔）尔） AF

13、P0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L TSH0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/ml FSH0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog0.08-120nmol/L 无无 0.1-40ng/ml Prolactin0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml时间分辨荧光技术TRFI

14、A技术25时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500 U/L 51002000Cps.10 3DELFIA hFSHN=6标准曲线稳定，试剂保质期时间长标准曲线稳定，试剂保质期时间长时间分辨荧光技术TRFIA技术26时间分辨荧光与化学发光方法学比较时间分辨荧光与化学发光方法学比较 发光效率发光效率 95%1% 重复检测重复检测 可无数次可无数次 不可重复不可重复本底噪声本底噪声 零本底零本底 干扰大干扰大灵敏级数灵敏级数 10-18 10-15标记物标记物 原子原子 大分子化合物大分子化合物

15、标记位点标记位点 可达可达20个个/抗体抗体 1个个/抗体抗体标准曲线标准曲线 稳定达一年以上稳定达一年以上 稳定稳定 2 到到 4周周多标记多标记 有，最多可达四标记有，最多可达四标记 无无科研开发科研开发 有有 无无时间分辨荧光技术TRFIA技术27时间分辨荧光和电化学发光的比较时间分辨荧光和电化学发光的比较 标记物标记物四种原子四种原子: Eu, Sm, Tb, Dy一种原子一种原子: 钌钌多标记技术多标记技术 有有 无无做科研做科研能能(1000多种科研项目多种科研项目) 无无 试剂种类试剂种类58种临床种临床,24种科研种科研, 28种临床种临床, 无科研试剂无科研试剂 共共82种种

16、试剂价格试剂价格 低低 高高时间分辨荧光技术TRFIA技术28时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫-突出优点突出优点 零本底、灵敏度高零本底、灵敏度高 线性范围宽线性范围宽 试剂有效期长试剂有效期长 标准曲线稳定性好标准曲线稳定性好 易于自动化易于自动化 对环境及人体没有任何影响对环境及人体没有任何影响TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。时间分辨荧光技术TRFIA技术29三、时间分辨荧光免疫技术三、时间分辨荧光免疫技术的临床应用的临床应用 (临床检测试剂盒简介临床检测试剂盒简介)时

17、间分辨荧光技术TRFIA技术30 内分泌科检查 1 、甲状腺功能系列、甲状腺功能系列 T3 三碘甲状原氨酸三碘甲状原氨酸T4 甲状腺素甲状腺素FT3 游离三碘甲状原氨酸游离三碘甲状原氨酸FT4 游离甲状腺素游离甲状腺素TSH-U 促甲状腺素促甲状腺素(超敏感超敏感)TBG Ab 甲状腺结合球蛋白甲状腺结合球蛋白TPO Ab 甲状腺过氧化物酶甲状腺过氧化物酶时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光技术TRFIA技术31临床意义概述：临床意义概述： 甲状腺是人体一个重要的内分泌腺，也是最大的内甲状腺是人体一个重要的内分泌腺，也是最大的内分泌腺体，甲状腺疾病也是目

18、前最常见最多发一种分泌腺体，甲状腺疾病也是目前最常见最多发一种内分泌疾病，对人体的正常功能可产生明显影响，内分泌疾病，对人体的正常功能可产生明显影响，甚至危及生命。甚至危及生命。 以上各项目的联合检测，为临床医生对病患者甲状以上各项目的联合检测，为临床医生对病患者甲状腺功能的评价提供更基础、全面的依据。腺功能的评价提供更基础、全面的依据。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光技术TRFIA技术322 、糖尿病系列、糖尿病系列 InS 胰岛素胰岛素 CP C肽肽 临床意义概述：临床意义概述： 了解残留胰岛了解残留胰岛细胞的功能，特别是用于区分胰细胞的功能，特

19、别是用于区分胰岛素依赖型糖尿病岛素依赖型糖尿病(IDDM)(IDDM)和非胰岛素依赖型糖尿和非胰岛素依赖型糖尿病病(NIDDM);(NIDDM); 用于胰岛素瘤的诊断等。用于胰岛素瘤的诊断等。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光技术TRFIA技术33 时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍3 、生长激素、生长激素 hGH 生长激素生长激素 临床意义概述：临床意义概述： 对诊断肢端肥大症是一项特异的方法；对诊断肢端肥大症是一项特异的方法； hGH低下还见于侏儒症和垂体前叶功能减退症如低下还见于侏儒症和垂体前叶功能减退症如席汉综合征

20、等。席汉综合征等。时间分辨荧光技术TRFIA技术34 妇产科检查（性激素） hCG 绒毛膜促性腺激素绒毛膜促性腺激素 LH-Spec 黄体生成素黄体生成素(特异性特异性) FSH 促卵泡激素促卵泡激素 PRL 催乳素催乳素 E2 雌二醇雌二醇 Testo 睾酮睾酮 Prog 孕酮孕酮 SHBG 性激素结合球蛋白性激素结合球蛋白时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光技术TRFIA技术35时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍临床意义概述临床意义概述 性激素是由性器官或肾上腺皮质分泌的，维持和调性激素是由性器官或肾上腺皮质分泌的，维持

21、和调节机体内正常生命，生理活动和生殖功能的一类甾节机体内正常生命，生理活动和生殖功能的一类甾体激素。体激素。 检测这些激素的含量对于生殖生理的研究、疾病的检测这些激素的含量对于生殖生理的研究、疾病的诊断、治疗、随访及计划生育工作的开展具有重要诊断、治疗、随访及计划生育工作的开展具有重要的意义。的意义。时间分辨荧光技术TRFIA技术36 肿瘤科检查 AFP 甲胎蛋白甲胎蛋白 PSA 前列腺特异抗原前列腺特异抗原 B2-M Beta 2微球蛋白微球蛋白 NSE 神经元烯醇化酶神经元烯醇化酶 PAP 前列腺酸性磷酸酶前列腺酸性磷酸酶 CEA 癌胚抗原癌胚抗原 PSA Free / total 前列腺

22、特异抗原前列腺特异抗原/总量总量时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光技术TRFIA技术37临床意义概述：临床意义概述： 肿瘤标志物（肿瘤标志物（Tumor Markers,TM)是指示体内肿瘤存是指示体内肿瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物质。通过测定其在并反映其一定的生物特性的生化物质。通过测定其存在或含量，对于肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导存在或含量，对于肿瘤可辅助诊断，分析病情，指导治疗，监测复发或转移及判断预后等。对现有治疗，监测复发或转移及判断预后等。对现有TM项目项目进行综合分析、多元分析，筛选出有价值的进行综合分析、多元分析，筛选出有价值

23、的TM，确定，确定一个最佳组合方式具有极大的临床意义。一个最佳组合方式具有极大的临床意义。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光技术TRFIA技术38 遗传科检查1 、产前筛查产前筛查 PAPP-A 妊娠相关血浆蛋妊娠相关血浆蛋 Free hCGBeta 游离绒毛膜促性腺激素游离绒毛膜促性腺激素 亚单位亚单位 AFP 甲胎蛋白甲胎蛋白 E3 游离雌三醇游离雌三醇h AFP/Free hCG 甲胎蛋白甲胎蛋白/游离绒毛膜促性腺激素游离绒毛膜促性腺激素 亚单位亚单位 临床意义概述：临床意义概述： 是预防患有严重遗传性疾病和先天畸形胎儿出生的一项是预防患有严重遗

24、传性疾病和先天畸形胎儿出生的一项有效措施。随着产前诊断技术的不断完善，产前诊断不有效措施。随着产前诊断技术的不断完善，产前诊断不仅为患儿的出生提供了客观依据，也使医师能在分娩过仅为患儿的出生提供了客观依据，也使医师能在分娩过程中和分娩后给予合适的处理。程中和分娩后给予合适的处理。时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光技术TRFIA技术39时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍2 、新生儿筛查、新生儿筛查 Neoneotal hTSH 新生儿筛查促甲状腺素新生儿筛查促甲状腺素 Neoneotal T4 新生儿筛查甲状腺素新生儿筛查甲

25、状腺素 Neoneotal 17 -OH-Prog 17-羟基酮羟基酮 Neoneotal PKU 新生儿筛查苯丙氨酸新生儿筛查苯丙氨酸临床意义概述：临床意义概述： 通过先进的实验室检测及早发现某些危害严重的先通过先进的实验室检测及早发现某些危害严重的先天性遗传代谢性疾病，从而早期诊断、早期治疗，天性遗传代谢性疾病，从而早期诊断、早期治疗，避免宝宝因脑、肝、肾等损害导致智力、体力发育避免宝宝因脑、肝、肾等损害导致智力、体力发育障碍甚至死亡。障碍甚至死亡。时间分辨荧光技术TRFIA技术40 血液科检查1 、贫血检查贫血检查 Ferritin 铁蛋白铁蛋白 Vit B12 维生素维生素B12 fo

26、late 叶酸叶酸2 、白血病分型、免疫细胞分型、细胞毒试、白血病分型、免疫细胞分型、细胞毒试验等验等 其它科研时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光技术TRFIA技术41时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍时间分辨荧光分析仪器测定项目介绍 传染科检查 乙肝系列乙肝系列 HBsAg 表面抗原表面抗原 HBsAb 表面抗体表面抗体 HBeAg e抗原抗原 HBeAb e抗体抗体 HBcAb 核心抗体核心抗体 开发中：抗开发中：抗HBcIgM 临床意义概述：临床意义概述： 为乙型肝炎临床早期诊断和治疗提供病原学依据。为乙型肝炎临床早期诊断和治疗提供病原学依据。能动态观察疗效和监测病情，对乙肝疫苗免疫力的能动态观察疗效和监测病情，对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义。评价和高危人群预防免疫具有重要意义。时间分辨荧光技术TRFIA技术42泰莱泰莱-I-I型时间分辨系型时间分辨系统统时间分辨荧光技术TRFIA技术43泰莱泰莱-型时间分辨系统型时间分辨系统时间分辨荧光技术TRFIA技术44使用使用TRFIATRFIA的理由的理由 一、专为中国医院量身定制一、专为中国医院量身定制 仪器、试剂的国产化，更适应我国国情，为各仪器、试剂的国产化，更适应我国国情，为各级医院开展高灵敏度的特种检验提供可行、低级医院开展高灵敏度的特种检验提供可行、低成本