研究方法和手段

1、一、显微镜技术二、细胞的分离及培养三、细胞组分的分离分离四、细胞内分子的示踪五、基本的分子生物学实验技术第一节 显微镜技术v光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。v电子显微镜：以电子束为光源。 1. 构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。laser confocal scanni

2、ng microscope, LCSMLCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)原理用途：观察未经染色的玻片标本淀粉电子显微镜电子显微镜 (Electron microscope)(Electron microscope) 1 1932932年德国学者年德国学者Max KnollsMax Knolls和和Ernst RuskaErnst Ruska用波长比光短得多的用波长比光短得多的电子作光源电子作光源, ,发明了第一台电子显发明了第一台电子显微镜，大大提

3、高了显微镜的分辨率，微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开拓了超微世界。开拓了超微世界。电子显微镜概述电子显微镜概述电子显微镜的基本结构电子显微镜的基本结构 电子显微镜基本结构由三大部分组成: 电子光学系统电子光学系统由照明系统、标本室、 成像系统、观察窗和记录用的照相机等 组成；真空系统真空系统是保持电镜的真空度；电子学系统电子学系统即供电系统，需要高压稳压。不同光线的波长不同光线的波长透透射射电电子子显显微微镜镜透射电子显微镜透射电子显微镜TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEMScanning electron microscope（ SEM）扫描电子显微镜原

4、理扫描电子显微镜原理电子染色电子染色 标本对电子的散射能力取决于其组成标本对电子的散射能力取决于其组成元素的原子序数元素的原子序数, ,原子序数越高原子序数越高, ,散射的电散射的电子越多子越多, ,反差就越大。生物分子是由一些原反差就越大。生物分子是由一些原子序数很低的轻元素子序数很低的轻元素( (氢、氧、碳、氮等氢、氧、碳、氮等) )组成的组成的, ,它们散射电子的能力很弱它们散射电子的能力很弱, ,在电镜在电镜下几乎不存在明暗反差。为使生物样品加下几乎不存在明暗反差。为使生物样品加大反差大反差, ,就要进行染色就要进行染色, ,即用重金属增加电即用重金属增加电子散射能力子散射能力, ,称

5、为电子染色。称为电子染色。电电镜镜样样品品的的制制备备制样技术 1）超薄切片）超薄切片 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。2）负染技术）负染技术Negative Stained Actin3）冰冻蚀刻）冰冻蚀刻 freeze-etching 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜

6、（replica）。A Yeast Cell第二节第二节 细胞分离和培养细胞分离和培养一、流式细胞术一、流式细胞术 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选快速定量分析与分选的一门技术。 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。二、细胞电泳二、细胞电泳 原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动

7、。 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同 。 用途：检测细胞生理状态和病理状态、分离不同种类的细胞，如分离哺乳动物的XY精子。三 细胞培养 原代培养原代培养 （primary culture）：即：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶，以1：2以上的比例扩大培养，称为传代或传代培养（Passage）。 细胞株细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 细胞系细胞系（cell line）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。 克隆克隆（c

8、lone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。实验室中常用的几种细胞系细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞Henrietta Lacks BHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP20骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 体外细胞培养的条件体外细胞培养的条件 环境因素环境因素 无菌环境、合适的温度、一定的渗透无菌环境、合适

9、的温度、一定的渗透 压和气体环境、压和气体环境、O O2 2和和COCO2 2。后者对于维。后者对于维 持细胞培养液的酸碱度十分重要。持细胞培养液的酸碱度十分重要。 代谢物和废物排除代谢物和废物排除：细胞融合 通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。 同核体同核体：相同基因型的细胞融合而成。 异核体：异核体：不同基因型的细胞融合而成。 自发融合：自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。 诱发融合：诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。 诱导细胞融合的方法：生物方法生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒

10、）、化学方法化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方物理方法法（电击和激光）。用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程图 第三节 细胞组分的分级分离一、分离细胞亚显微结构和大分子的超速离心法 离心技术是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。 转速为1025kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89K者称为超速离心机。 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。 （一）差速离心（一）差速离心 Differential centrifugation 特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。 用途：分离大小相差悬殊的细胞

11、和细胞器。 沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。 Low speedHigh speedDifferential centrifugation（二）密度梯度离心（二）密度梯度离心 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。 类型：速度沉降、平衡沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。1、速度沉降

12、 velocity sedimentation 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。2.平衡沉降平衡沉降 equilibrium sedimentation 用途：分离密度不等的颗粒。 特点： 介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。 所需的力场通常比速度沉降法大10100倍，往往需要高速或超速离心。 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度

13、的成分分离。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation可以分离蛋白质的层析法 又称色谱法 在本世纪初，俄国植物学家茨维特(MTswett) 将植物色素的石油醚提取液倾入装满碳酸钙颗粒的玻璃管中，再加入石油醚使其自由流下，结果植物色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的色谱带。这种方法被称为色谱法。装碳酸钙的玻璃管称为色谱柱(Column)，管内装的填料(如碳酸钙)称为固定相(Stationary phase)，淋洗液(如石油醚)称为流动相(mobile phase)。 层析法实质上是一种物理化学分离方法：即利用混合物中各组分在两相(固定相和流动相

14、)中溶解、析出、吸附、脱附、或其他亲和力和渗透性的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而得到互相分离。 按两相的物态分类：用气体作流动相称为气相层析(gas chromatography简称 GC)，用液体作流动相称为液相层析(1iquid chromatography，简称LC)。 按固定相所处的形式分类：柱层析、纸层析、薄层层析 按分离过程的物化原理分类：吸附层析法、分配层析、离子交换层析、凝胶层析法、亲和层析离子交换层析离子交换层析 (ion exchange chromatography) 利用固定相球形介利用固定相球形介质表面活性基团经质表面活性基团经化

15、学键合方法，将化学键合方法，将具有交换能力的离具有交换能力的离子基团在固定相上子基团在固定相上面，这些离子基团面，这些离子基团可以与流动相中离可以与流动相中离子发生可逆性离子子发生可逆性离子交换反应而进行分交换反应而进行分离的方法，称之为离的方法，称之为离子交换层析。离子交换层析。凝胶过滤层析凝胶过滤层析 利用凝胶层析介质 ( 固定相 ) 交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，又称之为排阻层析。 亲和层析在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而

16、进行分离的一种方法疏水层析利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法金属螯合层析 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法蛋白质电泳技术SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：最常用的变性电泳，可以用来测定蛋白质分子量。比层析法测定要好。 SDS 与蛋白质的疏水部分相合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。 SDS 蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。 SDS-PAGE分离蛋白等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）电泳是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。 等电聚焦电泳槽 双向电泳 第一向进行等电聚焦电泳，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离. 典型图谱典型图谱 质谱技术什么是质谱（Mass