VEGF受体KDR胞外Ⅴ～Ⅶ区的克隆、单抗制备及KDR在不同

1、VEGF受体KDR胞外区的克隆、单抗制备及KDR在不同来源肿瘤组织中的表达【摘要】目的利用制备的血管内皮细胞增殖因子(VEGF)受体KDR抗体，通过免疫组化，检测KDR在不同来源肿瘤组织中的表达，为探讨VEGF及其受体对肿瘤生长及转移的作用提供可能。方法采用RT-PCR方法，从人胎儿脐静脉内皮细胞克隆KDR胞外区基因片段，在大肠杆菌中表达，并用传统的杂交瘤融合技术制备小鼠KDR单克隆抗体。通过组化及Western-blot鉴定KDR单抗的特异性，最后采用S-P免疫组化法，分别对不同来源的115例肿瘤组织及相应正常组织进行了KDR表达分析。结果不同来源的肿瘤组织中，KDR受体的表达率及强度存在差

2、异，移行上皮来源的膀胱癌100%表达KDR，表达强度最高；乳腺癌及肠道腺癌细胞表达KDR次之；肺鳞癌表达最弱。此外，肿瘤组织中不仅血管内皮细胞表达KDR受体，且肿瘤细胞、血管平滑肌细胞及某些间质细胞也有KDR表达，而相应正常组织中KDR表达相对较弱。结论VEGF受体KDR不仅表达于肿瘤血管内皮细胞，而且表达于肿瘤细胞，肿瘤细胞表达KDR的强度与组织来源有关。【主题词】血管内皮生长因子受体分子克隆抗体，单克隆 Cloning and monoclonal antibody preparation of VEGF receptor KDR extracellular domain and KDR

3、expression in carcinomas of different originsSONG Shumei, ZENG Li, WU Jian, et al. Beijing Institute for Cancer Research, Beijing Medical University, Beijing 100034【Abstract】ObjectiveTo examine the expression of VEGF receptor KDR in carcinomas of different origins and provide possibility of explorin

4、g its relation to tumor growth and metastasis. MethodsVEGF receptor KDR cDNA () fragment was cloned from human umbilical vein with RT-PCR and expressed in E.coli Jm109. The purified GST-KDR fusion protein was used to immunize Balb/c mice and monoclonal antibody against KDR was prepared. With this mo

5、noclonal antibody, tumor tissue and related normal tissue of different origins were examined immunohistochemically for KDR expression. ResultsThe frequency and intensity of KDR expression in different tumor tissues were obviously different. Transitional-cell cancer of urinary bladder was 100% KDR po

6、sitive and with highest intensity, while KDR expression in breast and intestinal adenocarcinoma was weaker and that in squamous-cell carcinoma of the lung was weakest. Moreover, KDR was also weakly expressed in other cells, such as smooth muscle cells and interstitial cells. ConclusionVEGF receptor

7、is expressed not only in the endothelial cells of tumor vasculature, but also in tumor cells. Tumor cell expression of KDR varies in intensity with tumors of different origins. The possible significance of VEGF receptor expression with regard to tumor cell proliferation and metastasis is discussed.【

8、Subject words】Vascular endothelium growth factor receptorsMolecular cloningAntibodies, monoclonal新生血管生成是实体瘤生长的必要条件1。在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞能分泌许多血管内皮细胞(EC)增殖因子，如bFGF、VEGF等，刺激肿瘤血管的形成。其中VEGF是刺激EC增殖的最重要而直接的因子，它在肿瘤新生血管形成中起重要作用。研究表明，许多肿瘤组织及肿瘤细胞株中均表达这一因子2，3。已知VEGF的两种受体KDR和FLT-1均属细胞表面的酪氨酸激酶受体，并特异表达于血管内皮细胞4。然而近年来有人在巨噬

9、细胞及某些血液细胞中也检测到KDR受体表达5。Boocock等6用RT-PCR在卵巢癌细胞株和卵巢癌组织中的血管内皮细胞及肿瘤细胞中，均检测到FLT-1和KDR mRNA。这一结果提示，VEGF不仅作为旁分泌因子刺激血管内皮细胞增殖，同时还可能作为自分泌因子通过直接作用于肿瘤细胞自身的VEGF受体而促进肿瘤细胞生长。为进一步明确KDR在肿瘤细胞的表达及其与肿瘤组织来源的关系，了解VEGF及其受体在肿瘤发生发展中的作用机制，我们自脐静脉EC中克隆了KDR胞外区，并制备了相应单抗，运用KDR McAb研究了不同来源肿瘤组织中的KDR表达。材料与方法1.人脐静脉EC分离及KDR胞外区的cDNA合成和

10、扩增：按杨小平法7分离人脐静脉EC细胞，用RNA提取液Trisolv(美国Giotrx公司产品)按说明书提取EC中总RNA。根据KDR胞外区DNA序列合成5端引物：5-1：5-TAAGGATCCCA- CTCAAACGCTGAC-3及3端引物：3-1：5GGAGAA- TTCTCAACTGC ATGCCTGGCAG-3和3-2：5-TCCTGGGCACCTTCTA-3。用提取的3 g RNA及3-2引物，用逆转录酶M-ALV(Gibco公司)按说明行cDNA合成。取2.5 l逆转录产物为模板，以5-1和3-1为引物，通过PCR行KDR(-)DNA扩增，扩增条件为9445秒，481分钟，721.

11、5分钟，2个循环后将退火温度从48升至60，其余条件不变，继续扩增30个循环。PCR产物行酶切(BamH I/EcoR I)及测序鉴定。2.KDR胞外区的重组及表达：PCR产物经BamH I/EcoR I酶切、电泳分离纯化后，将其克隆在谷胱苷肽-S-转移酶(GST)表达载体pGEX2T(BamH I/EcoR I)中，并转化大肠杆菌Jm109，分别用蛋白表达及质粒DNA酶谱分析进行克隆筛选。挑取阳性克隆扩大培养，按文献方法8制备融合蛋白GST-KDR。3.KDR McAb制备及鉴定：用GST-KDR免疫Balb/c小鼠，用传统杂交瘤技术进行细胞融合。杂交瘤上清经ELISA双筛(选择抗GST-K

12、DR阳性而抗GST阴性者)和S-P组化筛选，经4次亚克隆后建株，并用Western-blot进一步鉴定抗体的特异性。4.不同来源肿瘤组织中KDR的表达分析：收集25例肺鳞癌、30例乳腺癌、25例大肠腺癌及35例膀胱移行细胞癌肿瘤手术切除标本的存档蜡块。用上述制备的KDR抗体，通过S-P免疫组化法进行常规组化染色，镜下观察结果。结果1.KDR胞外区cDNA片段的扩增及酶切鉴定：以逆转录的KDR cDNA为模板，在3.75 mmol/L Mg+浓度下进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，见900 bp左右有一特异条带，与理论推算值相符。用该特异片段构建的表达载体pGEX2T-KDR，经BamH

13、 I/EcoR I酶切后也可放出900 bp左右的条带(1)。M：DNA markers； 1：KDRV- RT-PCR产物；2：pGEX2T-KDR经BamH I/EcoR I酶切消化后1KDRV-区RT-PCR产物及pGEX2T-KDR酶切鉴定2.KDR表达及纯化：Jm109菌经pGEX2T-KDR转化，IPTG诱导后能稳定表达GST-KDR融合蛋白，表达蛋白约占菌体蛋白的10%左右，相对分子量约60 000，与推算值相符。该蛋白以包含体形式存在，用碱变性法提取，并经制备胶及电洗脱后得到纯化的KDR重组蛋白(2)。M：分子量标准蛋白；1：未经IPTG诱导的经pGEX2T-KDR转化的Jm1

14、09；2：经IPTG诱导的转化菌；3：经纯化后获得的GST-KDR融合蛋白2GST-KDR在大肠杆菌Jm109中的表达及纯化的GST-KDR融合蛋白3.KDR McAb制备及鉴定：经常规融合及4次亚克隆化，并用ELISA和组化筛选后获得12株KDR McAb，选取反应较强的SSW2制备腹水，并用蛋白A柱进行抗体纯化。纯化后的抗体经ELISA及Wes- tern-blot鉴定，同KDR抗原及血管内皮细胞均有较强的特异反应(3)。M：标准分子量蛋白；1：SSW2上清与KDR的反应；2：5株纯化KDR McAb混合物与KDR的反应；3：小鼠IgG与KDR的反应3KDR McAb行Western bl

15、ot分析KDR蛋白4.不同来源肿瘤组织中KDR表达：以免疫组化法检测115例不同来源的肿瘤组织，发现KDR在大多数肿瘤组织的肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞中呈强度不同的阳性反应。肿瘤细胞中的阳性产物呈棕黄色颗粒状，主要位于细胞浆和细胞膜上，部分肿瘤细胞以胞膜为主。在不同来源的肿瘤组织，移行上皮来源的35例膀胱癌肿瘤细胞100%表达KDR，且阳性程度以中度及强阳性为主；肿瘤组织中血管内皮细胞以弱阳性至中度阳性为主，亦有强阳性着染；间质中某些平滑肌细胞呈弱阳性反应，偶尔可见到部分淋巴细胞呈阳性反应。腺上皮来源的乳腺癌及肠癌组织中，肿瘤细胞的染色强度略弱于膀胱癌，KDR阳性百分率分别为92%及90%；血

16、管内皮细胞多呈弱阳性，部分呈中度阳性着色；而正常乳腺及肠道组织呈阴性。肺癌表达KDR阳性百分率为77%，表达强度明显弱于腺上皮及移行上皮来源的肿瘤。讨论VEGF是一种分泌型糖蛋白，它与肿瘤的血管发生密切相关，它不仅直接刺激EC细胞的生长，而且可提高微血管的通透性，促进血浆的外渗。通常认为VEGF是特异性内皮细胞生长因子，它通过作用于内皮细胞上的特异受体FLT-1和KDR/flk-1发挥其生物学作用，而KDR/flk-1和FLT-1的表达局限于内皮细胞。近年来，有人在非内皮细胞中，如成骨细胞和巨噬细胞中也检测到KDR表达5。Boocock等6用RT-PCR、原位杂交和免疫组化方法研究卵巢癌组织及

17、其细胞株中VEGF及其受体表达时发现，不仅肿瘤组织中血管内皮细胞有KDR表达，且肿瘤细胞本身也有KDR表达。本研究结果表明，KDR不仅表达于肿瘤组织的血管EC细胞，而且广泛表达于不同组织来源的肿瘤细胞，且肿瘤细胞表达KDR强度多高于EC细胞。我们还发现，除了肿瘤细胞、EC细胞表达KDR外，血管平滑肌细胞、肺癌中巨噬细胞、肠癌和膀胱癌中的淋巴细胞也有不同程度的表达。提示VEGF不仅是EC细胞增殖刺激因子，还可能通过表达于肿瘤细胞上的KDR受体而刺激肿瘤细胞的增殖或迁移，同时还可能通过间质组织细胞、M和淋巴细胞表达而促进间质的生成及局部免疫反应。本研究结果与Boocock等的报道基本一致，进一步提

18、示了VEGF通过自分泌或旁分泌途径影响肿瘤细胞的生长及间质中血管的形成，同时也说明了肿瘤细胞的生长与肿瘤间质之间的依存关系。我们还发现，不同来源的肿瘤细胞，KDR表达存在明显差异。来自移行上皮的35例膀胱癌细胞全部表达KDR，且其阳性程度高于肺鳞癌；腺上皮来源的乳腺癌和肠癌KDR也有较强的染色，而肺鳞癌染色较弱。KDR在不同来源肿瘤组织中表达差异的机理及其与肿瘤恶性程度的相关性以及VEGF结合肿瘤细胞KDR所诱发的一系列分子事件是否与内皮细胞KDR相同等问题，均有待进一步研究。本课题受国家杰出青年科学基金资助(基金编号：39525021)作者单位：100034 北京市肿瘤防治研究所北京医科大学

19、临床肿瘤学院宋述梅(现工作单位：430070 武汉，湖北省肿瘤研究所)、吴健、孟麟、寿成超(联系作者)；曾莉(北京医科大学泌尿外科研究所)参考文献1Folkman J. Tumor angiogenesis and tissue factor. Nature Medicine, 1996, 2：167-168.2Yashiji H, Gomez DE, Shibuya M, et al. Expression of VEGF, its receptor and other angiogenic factors in human breast cancer. Cancer Res, 1996,56：2013-2016.3Inoue K, Oreki Y, Suganuma T， et al. Vascular endothelial growth factor expression in primary esophageal squamous cell