秦岭大熊猫IFN-γ基因的克隆、表达及免疫活性研究

1、秦岭大熊猫IFN-基因的克隆、表达及免疫活性研究    英文题名 Gene Cloning、Expression and Bioactivation Detection of Ailuropoda Melanoleuca Qinlingensis IFN-  关键词 秦岭大熊猫; IFN-基因; 克隆; 表达; 生物学活性; 英文关键词 Giant Panda Qinling; interferon-gene; expression; bioactivity; 中文摘要 干扰素-(Interferon-gamma,IFN-)是一种具有抗病毒、抗

2、肿瘤和免疫调节作用的细胞因子,主要由活化的T细胞和NK细胞产生。IFN-对机体免疫系统具有强大的调节作用,是机体发挥免疫功能、清除体内病原体不可缺少的成分,因此,IFN-在疾病的诊断、治疗和疫苗免疫效果检测等方面起着重大作用。 大熊猫(AiluroPoda melanoleuca)是我国特有的珍稀野生动物。据国家林业总局最新公布的调查数字,野生大熊猫现存数量在1590只左右,人工圈养的大熊猫也仅有189只。其中秦岭大熊猫亚种,其总数大约273只,它们仍处于绝灭的边缘。由于野生条件的恶劣引发营养不良,免疫力低下,加之各种病原微生物的侵袭,最终导致机体衰竭而死及长期人工圈养的大熊猫(特别是幼年大熊

3、猫和老龄化大熊猫)大多免疫力低下,抗病毒、细菌和寄生虫感染的能力相对较弱。而对其疾病的防治目前仍以药物控制为主,并无专用疫苗,加上频繁用药导致耐药性菌(虫)株出现,以及药物自身存在的毒副作用,这些都给大熊猫的疾病防治及繁殖工作带来了很大的难度。因而为进一步搞好大熊猫的饲养管理及疾病控制,需要研究新的防治技术和药物,通过IFN-来改. 英文摘要 Interferon-gamma(IFN-)secreted by T lymphocytes and natural killer(NK)cells is an anti-viral and anti-tumor proliferation and i

4、mmunoregulatory cytokine 摘要 4-5 ABSTRACT 5-6 第一章 IFN-研究进展 10-19     1.1 IFN-的发现 10     1.2 IFN-的产生及分子结构 10-12     1.3 IFN-受体及作用机制 12-14     1.4 IFN-主要生物学功能 14-16         1.4.1 抗病毒作用 14    &#

5、160;    1.4.2 免疫调节作用 14-15         1.4.3 抗肿瘤作用 15-16     1.5 IFN-的基因工程研究进展 16-17     1.6 IFN-在动物疾病防控中的作用 17-18     1.7 存在的问题和展望 18-19 第二章 秦岭大熊猫的进化史等研究进展 19-24     2.1 秦岭大熊猫的进化史 19-20  &

6、#160;  2.2 秦岭大熊猫形态特征 20     2.3 秦岭大熊猫生活习性 20-21     2.4 秦岭大熊猫分布地域 21     2.5 秦岭大熊猫分子学研究进展 21     2.6 秦岭大熊猫保护措施 21-22     2.7 大熊猫疾病研究概况 22     2.8 大熊猫IFN-研究的目的和意义 22-24 第三章 秦岭大熊猫IFN-基因原核表达载体的构建 24-45  

7、   3.1 材料 24-27         3.1.1 菌种和载体 24         3.1.2 主要试剂 24         3.1.3 主要仪器 24-25         3.1.4 主要溶液配方 25-27     3.2 方法 27-37  

8、;       3.2.1 引物的设计与合成 27-28         3.2.2 秦岭大熊猫外周血淋巴细胞的分离与诱导培养 28         3.2.3 淋巴细胞总RNA 的提取及第一链cDNA 的合成 28         3.2.4 PCR 扩增 28-29      

9、;   3.2.5 PCR 扩增产物的凝胶电泳 29-30         3.2.6 PCR 扩增产物的回收 30         3.2.7 目的片段与载体的连接 30         3.2.8 感受态细胞的制备 30-31         3.2.9 连接产物的转化 31  

10、60;      3.2.10 菌液PCR 鉴定 31-32         3.2.11 碱裂解法小量提取质粒 32         3.2.12 重组质粒的鉴定 32-33         3.2.13 原核表达载体的构建 33-35         3.2.14

11、重组质粒的鉴定 35         3.2.15 重组菌的诱导表达 35         3.2.16 重组菌最佳诱导条件的确定 35-36         3.2.17 表达产物的检测 36-37     3.3 结果 37-42         3.3.1 RT-nested PCR

12、 扩增结果 37         3.3.2 重组质粒pGEM-T-IFN-的测序结果与序列分析结果 37-38         3.3.3 重组表达载体pET32a-IFN-的鉴定 38-40         3.3.4 表达产物的SDS-PAGE 电泳检测 40-41         3.3.5 表达条件的优化 4

13、1         3.3.6 Western blot 分析 41-42     3.4 讨论 42-44         3.4.1 秦岭大熊猫IFN-基因的扩增 42         3.4.2 秦岭大熊猫IFN-基因表达重组质粒的构建 42         3.4.3 目的蛋白的表

14、达 42-43         3.4.4 表达条件的优化 43         3.4.5 重组蛋白的大小及表达量 43-44         3.4.6 重组蛋白的反应原性鉴定 44     3.5 小结 44-45 第四章 IFN-重组蛋白的纯化 45-50     4.1 材料 45    

15、     4.1.1 主要试剂 45         4.1.2 主要仪器设备 45         4.1.3 用于蛋白纯化溶液的配制 45     4.2 方法 45-47         4.2.1 重组蛋白的大量诱导表达 45        

16、 4.2.2 目的蛋白存在情况检测 45-46         4.2.3 镍柱的处理 46         4.2.4 镍柱的再生 46         4.2.5 目的蛋白的纯化 46-47         4.2.6 纯化蛋白的浓缩 47       &

17、#160; 4.2.7 重组蛋白浓度的测定 47     4.3 结果 47-48         4.3.1 重组蛋白的制备及纯化 47-48         4.3.2 重组蛋白浓度的计算 48     4.4 讨论 48-49         4.4.1 目的蛋白存在形式检测 48-49    

18、;     4.4.2 目的蛋白的纯化 49     4.5 小结 49-50 第五章 重组IFN-蛋白多克隆抗体制备及其活性检测 50-55     5.1 材料 50         5.1.1 主要试剂及实验动物 50         5.1.2 主要仪器设备 50     5.2 方法 50-51   

19、;      5.2.1 多克隆抗体制备 50         5.2.2 重组蛋白活性检测 50-51     5.3 结果 51-53         5.3.1 抗体制备结果 51         5.3.2 重组蛋白活性检测结果 51-53     5.4 讨论 53-5

20、4         5.4.1 多克隆抗体制备 53         5.4.2 抗体检测方法 53-54         5.4.3 重组蛋白活性检测 54     5.5 小结 54-55 结论 55-56 参考文献 56-62 附录 62-63     4.5 小结 49-50 第五章 重组IFN-蛋白多克隆抗体制备及其活

21、性检测 50-55     5.1 材料 50         5.1.1 主要试剂及实验动物 50         5.1.2 主要仪器设备 50     5.2 方法 50-51         5.2.1 多克隆抗体制备 50         5.2.2

22、 重组蛋白活性检测 50-51     5.3 结果 51-53         5.3.1 抗体制备结果 51         5.3.2 重组蛋白活性检测结果 51-53     5.4 讨论 53-54         5.4.1 多克隆抗体制备 53       

23、;  5.4.2 抗体检测方法 53-54         5.4.3 重组蛋白活性检测 54     5.5 小结 54-55 结论 55-56 参考文献 56-62 附录 62-63     4.5 小结 49-50 第五章 重组IFN-蛋白多克隆抗体制备及其活性检测 50-55     5.1 材料 50         5.1.1 主要试剂及实验动物

24、 50         5.1.2 主要仪器设备 50     5.2 方法 50-51         5.2.1 多克隆抗体制备 50         5.2.2 重组蛋白活性检测 50-51     5.3 结果 51-53         5.3.1

25、抗体制备结果 51         5.3.2 重组蛋白活性检测结果 51-53     5.4 讨论 53-54         5.4.1 多克隆抗体制备 53         5.4.2 抗体检测方法 53-54         5.4.3 重组蛋白活性检测 54  

26、60;  5.5 小结 54-55 结论 55-56 参考文献 56-62 附录 62-63     4.5 小结 49-50 第五章 重组IFN-蛋白多克隆抗体制备及其活性检测 50-55     5.1 材料 50         5.1.1 主要试剂及实验动物 50         5.1.2 主要仪器设备 50     5.2 方法 50-51 &#

27、160;       5.2.1 多克隆抗体制备 50         5.2.2 重组蛋白活性检测 50-51     5.3 结果 51-53         5.3.1 抗体制备结果 51         5.3.2 重组蛋白活性检测结果 51-53     5.4 讨论 53-54         5.4.1 多克隆抗体制备 53         5.4.2 抗体检测方法 53-54