细菌感受态细胞摄取和分泌DNA的相关性研究

1、    细菌感受态细胞摄取和分泌DNA的相关性研究I. 含有质粒的枯草芽孢杆菌自然感受态缺陷突 变株的诱变和分离 谢志雄陈向东陈琪沈萍 摘要以携带pUB110质粒的枯草芽孢杆菌BR151菌株为出发菌株，利用亚硝基胍作诱变剂，直接在LB平板上进行诱变。从2949个菌落中筛选出一个转化频率低于出发菌株23个数量级的突变株，并对其营养缺陷型、UV的敏感性及Km抗性和质粒进行了检测，确证其转化能力降低为自然感受态缺陷而非营养缺陷型的改变或重组缺陷所致。 关键词枯草芽孢杆菌,自然感受态缺陷突变株,诱变,筛选 中图分类号Q933 Study of the Inter

2、relations Between DNA Uptake and Secreting of Competent Bacterial Cells I. Mutagenesis and Isolation of Natural Competence-deficient Mutant from Containing Plasmid Bacillus subtilis XIE Zhi-XiongCHEN Xiang-DongCHEN QiSHEN Ping (College of Life Sciences,Wuhan University,Wuhan430072) AbstractNatural c

3、ompetence-deficient mutant of Bacillus subtilisBR151, which carries plasmid pUB110, was obtained by nitrosoguanidine mutagenesis on solid medium. From 2949 clones, a mutant, the transformation frequency of which is 102103times lower than that of the control, was obtained and tested for the changes o

4、f trophic type, resistance to Km, plasmid and sensitivity to UV. The results indicate the reduction of transformation frequency is due to competence-deficient mutation. Key wordsBacillus subtilis,Natural competence-deficient mutant,Mutagenesis,Screening 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）自然感受态的建立涉及到10多个基因的功能1

5、，这些基因的有序表达，使其具有摄取外源DNA的能力，用以补充营养、修复DNA损伤以及获得抗逆性等新的遗传性状，从而适应不断变化的环境2, 3, 4。近年来的研究发现，处于感受态的细胞不仅具有摄取DNA的能力，而且在此状态下细胞也处于DNA分泌的高峰，且分泌的DNA具有遗传转化活性5, 6。但DNA摄取和分泌之间的关系等方面的研究目前还未见报道。这方面的研究有助于了解和揭示自然遗传转化中供体的功能，也将为分子生物学、生物进化等方面的研究提供新的思路，此外，在遗传工程微生物（GEMs）的构建和合理使用等方面也将具有理论与应用价值。 为了研究自然感受态的建立与DNA（包括染色体DNA和质粒DNA）分

6、泌的关系，首先需获得自然感受态缺陷的突变株。因此，我们以一株含有质粒的枯草芽孢杆菌为出发菌株进行诱变，以期获得为进一步研究所需的自然感受态缺陷菌株。 1材料与方法 1.1菌株 B. subtilis携带pUB110质粒（Kmr）的菌株、B. subtilis BR151 (trpC2metB5 lys3amyKms）和B. subtilis 168菌株(ilvA1pyrD1trpC2 Kms)，均由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供。 1.2培养基 LB(/L)：蛋白胨 10g；酵母抽提物 5g；氯化钠 5g；pH7.2。 Spizizen基本培养基(/L)：葡萄糖 5g；MgSO4.7

7、H2O 0.2g ；(NH4)2SO42g；K2HPO4.3H2O 18.34g；KH2PO4 6g；柠檬酸钠.2H2O 1g。 选择培养基：Spizizen基本培养基补加50g/ml Met和20g/ml Trp。固体培养基另加琼脂粉至1.5%。 1.3方法 1.3.1B. subtilis总DNA及质粒DNA制备纯化方法参见文献7, 8改进。 1.3.2pUB110质粒转化BR151菌株的方法参见文献9。 1.3.3诱变方法参见文献10。以亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, NG or NTG)作诱变剂，直接在LB平板上进行诱变。

8、1.3.4筛选方法参考文献9, 10。 1.3.5染色体DNA液体转化方法参见文献9。 1.3.6UV敏感性检测方法参见文献4, 9, 11。 2结果和讨论 2.1出发菌株的选择 为了获得用以研究自然感受态的建立与DNA（特别是质粒DNA）分泌的关系为目的的感受态缺陷突变株，其出发菌的选择至关重要。因为所获得的缺陷型不仅要稳定，而且还要有利于DNA分泌的研究。因此我们选择了具有多重营养缺陷（trp-、met- 和lys-）标记，能自然建立感受态的枯草芽孢杆菌BR151为出发菌株，并将pUB110质粒（Kmr）导入其细胞内，构建成含有质粒、具多重营养缺陷及Kmr的出发菌株，称之为BR151p。在

9、这样的选择压力下，可使获得的突变株稳定，且保持所含质粒。 自然感受态缺陷型的选择标准是看其是否丧失或降低了摄取外源DNA的能力。我们选择来自枯草芽孢杆菌168（trp-、ilv- 和pyr-）的总DNA为转化DNA，在选择平板上进行筛选。经诱变处理后的BR151p在选择平板上不能生长或生长很差者，可初步判断它们感受态建立受阻，不能摄取和表达外源DNA，然后可再经多次重复和复筛进一步确证。 2.2感受态缺陷型的筛选 将固体NTG直接点于涂布有BR151p的LB平板上，经37过夜培养后，从NTG抑菌圈边缘，刮取菌苔稀释涂布于LB平板，挑单菌进行筛选。 从2949个菌落中获得727个在点有168菌株

10、总DNA的选择平板上不长而在LB平板上生长的菌落，经进一步复筛，从中获得52个菌落，再进行液体转化实验，得到7个转化频率低于出发菌株1个数量级以上的突变株，其中BR151pm转化频率低于出发菌株23个数量级（图1）。 图1转化频率变化 2.3突变株的鉴定 2.3.1自然感受态的变化BR151pm、BR151p和BR151菌株在相同条件下生长表现一致，转化频率变化趋势相似，经多次传代进行液体转化实验，BR151pm菌株转化频率均低于BR151p和BR151菌株23个数量级（图1），结果稳定。 2.3.2遗传标记检测BR151pm菌株在补加Met、Trp和Lys的Spizizen基本培养基上可以生

11、长，且必须此三种氨基酸，与BR151p菌株的营养要求一致，这说明BR151pm菌株转化频率的降低不是由于产生新的营养缺陷形成共转化所致。而很可能是负责感受态建立的某些基因发生了突变。该突变株仍保留着原来的选择标记，符合进一步研究的要求。 2.3.3UV敏感性检测为了进一步证实我们所获得的转化频率降低的突变确实是因为感受态缺陷所致，我们进一步进行了UV敏感性检测。因为建立自然感受态的细胞摄取的外源DNA需经过同源重组才能整合到染色体上，重组缺陷会导致外源DNA无法有效整合，使转化频率降低。重组缺陷型菌株对UV造成的DNA损伤的修复能力低于非重组缺陷型菌株，因此, 对UV的敏感性与非重组缺陷型菌株

12、不同，故可利用对UV敏感性的变化来判断其是否为重组缺陷4, 9, 11 。 相同条件下，BR151pm菌株与BR151p菌株的存活曲线基本吻合，表明BR151pm菌株不是重组缺陷型，其转化频率的降低不是由于重组缺陷造成的。从而进一步证实我们获得的突变株为感受态缺陷。 2.3.4质粒检测BR151pm菌株保存有Km抗性。进一步检测其质粒，发现其质粒DNA大小没有变化；酶切结果与文献7报道的pUB110的物理图谱一致，两个常用克隆位点，Bgl和BamHI位点没有改变。 我们通过诱变筛选得到自然感受态缺陷突变株BR151pm。营养缺陷型、UV敏感性及Km抗性和质粒检测结果表明，造成BR151pm菌株

13、转化能力降低的原因，不是NTG诱变使得其营养缺陷型发生改变或引起重组缺陷，而是可能与感受态建立的相关基因发生突变造成的，详情还需进一步的研究。 国家自然科学基金(39670397)资助的项目。文中插图由陈宝联同志绘制, 在此谨致谢意! 作者单位：武汉大学生命科学学院, 武汉430072 参考文献 1Dubnau D. The regulation of genetic competence in Bacillus subtilis.Mol. Microbiol., 1991, 5: 1118 2Lorenz M G, Wackernagel W. Bacterial gene transfer

14、 by natural genetic transformation in the environment. Microbiol. Rev., 1994, 58: 563602 3沈萍，彭珍荣. 自然转化的研究进展. 遗传，1995, 17(增刊)：8991 4沈萍编著. 微生物遗传学. 武汉：武汉大学出版社, 1995 5许传东，沈萍. 大肠杆菌核酸分泌及其转化活性的研究. 武汉大学学报（自然科学版）, 1996, 生物工程专刊：7780 6Lorenz M G, Gerjets D, Wackernagel W. Release of Transforming Plasmid and Ch

15、romosomal DNA from Two Cultured Soil Bacteria. Arch. Microbiol., 1991, 156: 319326 7Bron S. Plasmids. In: C. R. Harwood and S. M. Cutting (ed.). Molecular biological methods forBacillus.John Wiley and Sons, Inc., New York, 1990, pp. 75174 8Cutting S M, Horn P B V. Genetic analysis. In: C. R. Harwood and S. M. Cutting (ed.). Molecular biological methods forBacillus.John Wiley and Sons, Inc., New York, 1990, pp. 2774 9Fani R, Mastromei Get al.Isolation and characterization of Bacillus subtilismutants altered in competence. J. Bacteriol., 1984, 157: 152157 10陈中孚, 潘星时, 沈淑瑜.