急性胰腺炎患者肠黏膜屏障功能损害相关研究_图文

1、DOI :107683/xxyxyxb201405021收稿日期 :20140227作者简介 :介卫华 (1971 , 女 , 河南舞阳人 , 学士 , 主治医师 , 主要从事消化内科相关疾病的研究欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁 欁欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 欁 氉氉氉氉。 本文引用 :介卫华 , 李爱红 急性胰腺炎患者肠黏膜屏障功能损害相关研究 J 新乡医学院学报 , 2014, 31(5 :391-394, 397【 临床研究

2、 】急性胰腺炎患者肠黏膜屏障功能损害相关研究介卫 华 1, 李 爱 红2(1漯河市中医院内三科 , 河南漯河 462000; 2漯河市中医院重症监护病房 , 河南漯河 462000摘要 :目的探讨急性胰腺炎 (AP 患者肠黏膜屏障功能改变机制 。 方法 61例 AP 患者按病情程度分为重症组 (n =31 和轻型组 (n =30 , 另选肠镜检查志愿者作为对照组 (n =30 , 电镜观察肠黏膜超微结构变化 , 比较血清内 毒素 、 白细胞介素 -18(IL-18 及肠黏膜 ZO-1、 Occludin 的变化 。 结果 对照组 ZO-1和 Occludin 蛋白为棕黄色 , 染色较强 , 成

3、点状聚集 ; 轻型组和重症组患者肠黏膜 ZO-1和 Occludin 蛋白的染色变浅 。 轻型组和重症组患者肠黏膜 ZO-1和 Occludin 蛋白光密度水平较对照组下降 (P 005, 001 。 与轻型组比较 , 重症组患者肠黏膜光密度水平降低 (P 0. 05 。 轻型组和重症组患者肠黏膜 ZO-1、 Occludin 基因水平较对照组下降 (P 005, 001 ; 重症组患者肠黏膜 ZO-1、 Occludin 基因水平较轻型组下降 (P 005 。 轻型组和重症组患者内毒素和 IL-18水平均高于对照组 , 差异有统计 学意义 (P 005, P 001 。 重症组患者肠黏膜内毒

4、素和 IL-18水平高于轻型组 , 差异有统计学意义 (P 005 。 血 清内毒素 、 IL-18水平与 ZO-1蛋白和 Occludin 蛋白表达均呈负相关 (r =079、 064、 071、 061, P 005 。 结论AP 患者早期肠黏膜受损 , 肠黏膜通透性增加 。 内毒素和 IL-18可能协同或单独参与肠黏膜的破坏 。 关键词 :急性胰腺炎 ; 肠黏膜屏障功能 ; ZO-1; Occludin ; 白细胞介素 -18中图分类号 :576文献标志码 :A文章编号 :1004-7239(2014 05-0391-05Study on intestinal mucosal barri

5、er dysfunction in patients with acute pancreatitis JIE Wei-hua 1, LI Ai-hong 2(1Department of Internal Medicine , the Chinese Traditional Medicine Hospital of Luohe City , Luohe 462000, Henan Province , China ; 2Intensive Care Unit of Chinese Traditional Medicine Hospital of Luohe City , Luohe 46200

6、0, Henan Province , China Abstract :ObjectiveTo explore the mechanism of changes of intestinal mucosal barrier function in acute pancreatitis(AP patientsMethodsSixty-one patients with AP were divided into severe group (n =31 and mild group (n =30 accord-ing to disease severity , another colonoscopy

7、volunteers were selected as control group (n =30 The ultrastructural changes of intestinal mucosa were observed by electron microscopeThe content of serum endotoxin and interleukin-18(IL-18 , ZO-1and Occludin in the intestinal mucosa was comparedesultsZO-1and Occludin protein staining was brown and

8、strong withpunctate aggregation in the control group and the staining was shallow in mild group and severe groupThe optical density of ZO-1and Occludin protein in mild group and severe group were significantly lower than those in the control group (P 005, 001 The optical density of ZO-1and Occludin

9、protein in severe group were significantly lower than those in mild group (P 005 Compared with the control group , the levels of ZO-1and Occludin gene in mild group and severe group decreased (P 0. 05, P 001 ; compared with mild group , the levels of ZO-1and Occludin gene in severe group decreased (

10、P 005 The serum endotoxin and IL-18content in mild group and severe group were significantly higher than those in control group (P 0. 05, P 001 The serum endotoxin and IL-18content in severe group were significantly higher than that in mild group (P 005 There were significant negative correlations b

11、etween serum endotoxin , IL-18and ZO-1, Occludin (r =079, 064, 071, 061, P 005 Conclusion The intestinal mucosal membrane of patients with AP is damaged , and the intestinalmucosal membrane permeability is increasedEndotoxin and IL-18may take part in the intestinal mucosa damage through syn-ergism o

12、r aloneKey words :acute pancreatitis ; intestinal barrier function ; ZO-1; Occludin ; interleukin-18急性胰腺炎 (acute pancreatitis , AP 为消化内科 常见病 、 多发病 , 是由多种原因造成胰蛋白酶激活后所致的胰腺组织自身消化的化学性炎症 , 病死率高 ,与胰蛋白酶 、 补体系统激活 , 炎性因子的参与存在一定的联系 1。 此外肠道黏膜缺血受损导致的细菌 易位在 AP 发生 、 发展中亦有重要作用 。 目前肠黏 膜屏障功能受损研究还多处于动物实验阶段 , 炎性 因子在重症

13、 AP 患者肠黏膜屏障功能损伤中的作用193第 31卷 第 5期 2014年 5月 新乡医学院学报Journal of Xinxiang Medical University Vol31No5May 2014仍不明确 2, 本研究在肠黏膜超微结构 、 血清学 、 细 胞 、 分子水平上探讨 AP 患者肠黏膜屏障功能损害 的发病机制 , 为 AP 的治疗提供依据 。1资料与方法11一般资料 选择 2012年 6 12月在漯河市中 医院消化科住院治疗的 AP 患者 61例 , 所有患者均 符合 AP 诊断标准 3, 并经彩色超声及 CT 明确诊 断 。 且具备下列之一者诊断为重症 AP :局部并发

14、症 (胰腺坏死 、 假性囊肿 、 胰腺脓肿 和部分器官衰竭 ; anson评分 3; 急性生理和慢性健康状况评分 (a-cute physiology and chronic health evaluation scoring system , APACHE - 评分 8, CT 分级 D 级以上 。 入选患者均在发病 48h 内入院接受治疗 。 按照病 情严重程度分为 2组 。 重症组 31例 , 均为重症 AP 患者 , 其中男 13例 , 女 18例 ; 年龄 28 81岁 , 平均 (514 10. 2 岁 ; APACHE- 评分 8; CT 分级为 D 、 E 级 ; 病因 :胆石

15、症 18例 , 乙醇性 8例 , 高脂血症 3例 , 特发性 2例 。 轻型组 30例 , 均为轻型 AP 患 者 , 其中男 13例 , 女 17例 ; 年龄 28 80岁 , 平均 (523 107 岁 ; APACHE- 评分 8; CT 分级为 A 、 B 、 C 级 ; 病因 :胆石症 16例 , 乙醇性 9例 , 高脂血 症 2例 , 特发性 3例 。 另选取同期 30例接受肠镜检 查健康志愿者作为对照组 , 其中男 14例 , 女 16例 ; 年龄 29 79岁 , 平均 (517 101 岁 ; 查体无消化 系统疾病 。 以上入选者近期均无胃肠道手术史 、 无 慢性胃肠道疾病史

16、和糖尿病史 。 3组受试者在性 别 、 年龄等一般资料比较差异无统计学意义 (P 0. 05 。 以上人员均 告 知 本 研 究 并 签 署 知 情 同 意 书 。12CT 分级标准 A 级 :正常胰腺 ; B 级 :胰腺实 质改变 , 包括局部或弥漫的腺体增大 ; C 级 :胰腺实 质及周围炎症改变 , 胰周轻度渗出 ; D 级 :除 C 级外 , 胰周渗出显著 , 胰腺实质内或胰周单个液体积聚 ; E 级 :广泛的胰腺内 、 外积液 , 包括胰腺和脂肪坏死 、 胰 腺脓肿 4。13标本选取 所有入组的研究对象均先行肠道 通透性检查 , 再行结肠镜检查 。 所有患者均在结肠 镜下直乙结肠交界

17、处取活检组织 。14透 射 电 镜 观 察 肠 黏 膜 组 织 用 体 积 分 数2. 5%戊二醛固定 , 磷酸盐缓冲液 (phosphate buffer solution , PBS 漂洗 , 锇酸固定 , 环氧树脂包埋 , 半薄 切片定位 , 超薄切片 , 醋酸双氧铀 -柠檬酸铅双重电 子染色 , 透射电镜水平观察患者肠黏膜结构 、 细胞间 紧密连接改变及肠黏膜细胞超微结构改变 。15ZO-1、 Occludin 蛋白检测 采用链霉菌抗生 物素蛋白 -过氧化物酶 (streptavidin-perosidase , SP 法 。 细胞质或细胞核呈棕黄色为阳性细胞 。 PBS 代 替一抗作

18、阴性对照 。 每组随机抽取不同的切片 8张 , 每张切片于光镜下 ( 400 随机选取 5个视野 , 固定窗口面积 , 利用美国 Universal Imaging Corpora-tion 图像分析系统 , 应用 MetaMorph 软件分析平均 光密度值 。16血清内毒素 、 白细胞介素 (interleukin , IL -18水平的测定 抽取患者入院前血液 , 均置于 70 冰箱保存 , 待测 。 鲎试剂偶氮基质显色法定量检测 内毒素 , 采 用 鲎 试 剂 型 , 545nm 处 测 定 光 密 度 (optical density , OD 值 , 按说明制定标准曲线 , 根据 样

19、品 OD 值查出相应的内毒素水平 。 鲎试剂 型购 自上海伊华临床医学科技公司 。 酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA 双 抗 体 夹心法测定 IL-18水平 , 在 492nm 处测定 OD 值 , 绘 出标准曲线 。 根据样品 OD 值求出标本中 IL-18水 平 。 ELISA 试剂盒购自深圳达科生物技术有限公司 。 17反转录聚合酶链反应 (reverse transcription-polymerase chain reaction , T-PC 检测 ZO-1和 Occludin mNA的表达 TIzol提取组织总

20、 NA, 30 1h , 95 5min , 5 1h 合成 cDNA 。 引物序 列 :ZO-1上 游 引 物 :5-TACCTCTTGAGCCTT-GAACTT-3 ; 下游引物 :5-CGTGCTGATGTGCCATA-ATA-3 ; 扩增产物长度 267bp ; 95 3min , 94 40s , 62 40s , 72 50s , 72 10min , 30个循 环 。 Occludin 上游 引 物 :5-TGCATGTTCGACCAAT-GC-3 ; 下 游 引 物 :5-AAGCCACTTCCTCCATAAGG-3 ; 扩增产物长度 251bp ; 95 3min , 94

21、40s , 62 40s , 72 40s , 72 10min , 29个 循 环 。 GAPDH 上游引物 :5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ; 下游引物 :5-TCCACCACCCTTTGCTGTA-3 ; 扩增 产物长 度 287bp ; 95 3min , 94 40s , 54 40s , 72 1min , 72 3min , 30个循环 。 成像分 析 :将 PC产物于质量分数 1%琼脂糖凝胶中电泳 , UVP 成像分析系统拍照观察 。 Quantity One 软件进 行灰度分析 , 每组实验重复 5次 , 计算目的基因条带 与内参照 (GAPDH 的灰度比

22、值 。18统计学处理 应用 SPSS 160统计学软件进 行数据处理 。 计数资料采用 2检验 , 计量资料以均 数 标准差 (珋 x s 表示 , 采用单因素方差分析 , 两两 比较采用 SNK 法 , 采用 Spearman 进行等级相关分 析 , P 005为差异有统计学意义 。2结果21透射电镜观察结果 透射电镜示对照组结肠 上皮细胞间连接复合体的染色强且连续 (图 1A ; 轻型组和重症组部分患者上皮连接复合体的染色较对照组明显变浅 , 且不连续 , 上皮细胞肿胀僵硬 , 细 胞间连接疏松 、 间距增宽 (图 1B 、 1C 。22ZO-1和 Occludin 蛋白表达情况 对照组肠

23、 黏膜 ZO-1、 Occludin 蛋白为棕黄色 , 染色较强 , 成点 状聚集 ; 轻型组和重症组患者肠黏膜 ZO-1、 Occludin 蛋白的染色变浅 (图 2 。 轻型组和重症组患者肠黏 膜 ZO-1和 Occludin 蛋白光密度水平较对照组下降 (P 0. 05, P 001 ; 与轻型组比较 , 重症组患者光 密度水平显著降低 (P 005 ; 见表 1 。A :对照组 ; B :轻型组 ; C :重症组 。图 1透射电镜观察 3组受试者肠黏膜结构变化 ( 24000Fig1Changes of intestinal mucosal structure of the three

24、 groups observated by transmission electron microscope ( 24000 A :对照组 (ZO-1 ; B :轻型组 (ZO-1 ; C :重症组 (ZO-1 ; D :对照组 (Occludin ; E 轻型组 (Occludin ; F :重症组 (Occludin 。图 2ZO-1和 Occludin 蛋白在各组受试者肠黏膜中的表达 (SP , 400Fig2Expression of ZO-1and Occludin protein in intestinal mucosal of the three groups (SP , 400

25、表 1各组受试者肠黏膜中 ZO-1和 Occludin 蛋白的表达Tab1Expression of ZO-1and Occludin protein in intesti-nal mucosal in each group (珔 x s 组别 n ZO-1Occludin对照组 30041 003036 002轻型组 30037 002a 033 001a重症组 31033 002bc 028 001bc注 :与 对 照 组 比 较 a P 005, b P 001; 与 轻 型 组 比 较 c P 0. 05。23血清内毒素和 IL-18水平 结果见表 2。 轻型组和重症组患者内毒素和 I

26、L-18水平均高于对照组 , 差异有统计学意义 (P 005, P 001 。 重症组患者内毒素和 IL-18水平高于轻型组 , 差异有统计学意义 (P 005 。24T-PC检测结果 轻型组和重症组患者ZO-1、 Occludin 基因水平较对照组下降 (P 005,0. 01 ; 重症组患者 ZO-1、 Occludin 基因水平较轻型组下降 (P 005 。 见表 3和图 3。表 2各组受试者血清中内毒素和 IL-18含量比较Tab2Comparison of contents of serum endotoxin and IL-18in each group (珔 x s 组别 n 内

27、毒素 /(EU L 1 IL-18/(ng L 1 对照组 303123 10112635 802轻型组 3025113 3137a 3512 1724a 重症组 3137239 7129b 7724 1516bc 注 :与 对 照 组 比 较 a P 005, b P 001; 与 轻 型 组 比 较 c P 0. 05。表 3各组肠黏膜中 ZO-1和 Occludinm NA表达Tab3Expression of ZO-1and Occludin mNAin intesti-nal mucosal in each group (珔 x s 组别 n ZO-1Occludin 对照组 301

28、13 007089 005轻型组 30078 002a 063 003a 重症组 31052 002bc 041 001bc 注 :与 对 照 组 比 较 a P 005, b P 001; 与 轻 型 组 比 较 c P 0. 05。 图 3ZO-1和 Occludin 基因扩增结果Fig3esultsof ZO-1and Occludin gene amplification 25相关性分析结果 血清内毒素 、 血清 IL-18水 平与 ZO-1蛋白和 Occludin 蛋白表达均呈负 相 关 (r =079、 064、 071、 061, P 005 。3讨论重症 AP 发生后继发感染致

29、死率较高 5, 而胰 腺炎患者感染多为肠道细菌异位引起 。 有研究指出 其感染的发生与肠黏膜屏障通透性增加及功能受损 有关 , 患者肠黏膜上皮细胞间紧密连接的超微结构 改变 , 肠道内细菌 、 毒素等有害物质进入机体的重要 部位 , 引发肠源性内毒素血症 6。 本研究显示 , AP 患者内毒素水平明显高于对照组 , 尤其是重症组 , 提 示 AP 患者存在肠屏障功能损伤 , 与文献报道 3一 致 。 电镜显示部分 AP 患者肠黏膜上皮连接复合体 的染色较浅 , 且不连续 , 上皮细胞肿胀僵硬 , 细胞间 连接疏松和间距增宽 。Occludin 和 ZO-1蛋白是肠黏膜上皮细胞紧密 连接结构主要

30、的功能蛋白 , 其中 Occludin 是构成紧 密连接的重要跨膜蛋白 7, 与 ZO-1紧密相连 , 能保 持紧密连接固定于细胞膜及其连续性 8, 同肠上 皮 、 基膜共同构成肠黏膜屏障 , 避免肠内营养物质 、 细菌 、 毒素及大分子物质通过细胞间隙漏入肠腔 。 本研究显示 , AP 患者肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白 Occludin 和 ZO-1染色较对照组减弱 , 部分患者出现 连续性中断 , 部分严重的患者紧密连接丧失原有结 构 , 部分断裂且细胞间连接松散 。 同时通过蛋白表 达比较发现 , 患者的 Occludin 和 ZO-1蛋白水平较对 照组明显下降 , 提示 AP 患者体内存

31、在某些因子导 致肠黏膜上皮紧密连接蛋白表达下降并重排 , 屏障 功能受损 , 肠黏膜上皮细胞通透性增高 。IL-18是细胞因子 IL 家族中一员 , 起初由干扰 素 -介导 , 由巨噬细胞 、 中性粒细胞 、 上皮细胞 、 树 突样细胞等多种细胞产生 , 促使 T 细胞向 Th1细胞 转化 。 有文献证实其可以在炎症性肠病 、 关节炎 、 败 血症中引起组织损伤 , 在免疫调节 、 抗感染及炎症性 病变中占重要地位 9。 实验证实 IL-18在重症 AP 患者血清中的表达增高 , 可作为重症 AP 的预测指 标 10。 部分研究显示 , IL-18在肠黏膜屏障功能受 损中占据重要地位 11,

32、能减低紧密连接相关蛋白 ZO-1等的表达 , 增加肠黏膜通透性 。 本研究中 , 重 症组患者血清 IL-18水平明显高于轻型组 , 提示 IL-18水平与患者严重程度相关 , 这与 au等 12的研 究结果一致 。本研究将血清内毒素和 IL-18水平与肠黏膜 ZO-1、 Occludin 蛋白的光密度值进行相关性分析 , 结 果显示 , AP 患者紧密连接相关蛋白 ZO-1、 Occludin 低表达 , 与血清内毒素呈负相关 , 提示肠黏膜间紧密 连接受损 , 肠黏膜通透性增加 。 IL-18在重症 AP 患 者中的水平高于健康人 , 与紧密连接相关蛋白 ZO-1、 Occludin 表达

33、水平呈负相关 。 提示 IL-18可能影 响肠黏膜上皮紧密连接蛋白表达下降并重排 , 可能 是患者肠道屏障损伤的机制之一 。 因此 , 降低肠道 通透性及血清 IL-18水平 , 可能对肠黏膜屏障起保 护作用 。总之 , AP 患者肠黏膜受损 , 肠黏膜通透性增加 。 部分细胞因子可能协同或单独参与肠黏膜的破坏 。 因此减轻炎症反应 , 保护肠黏膜屏障功能 , 降低内毒 素血症 , 对 AP 患者的治疗具有积极意义 。参考文献 :1雷亿群 , 张建平 , 俞春钊 , 等 乌司他丁对急性胰腺炎患者炎性 因子的影响 J 中国生化药物杂志 , 2012, 33(6 :900-9012邹忠东 , 张再

34、重 , 王烈 , 等 肠淋巴途径在大鼠重症急性胰腺炎 致全身炎症反应中的作用 J 中国危重病急救医学 , 2010, 22 (4 :206-2093梁坚 , 周宇 , 王壮 , 等 急性胰腺炎肝损害与血清 IL-18、 TNF-、 NO 的关系 J 南方医科大学学报 , 2010, 30(8 :1912-19144中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组 中国急性胰腺炎诊 治指南 :草案 J 中华消化杂志 , 2004, 24(3 :190-1925石金河 , 张建新 , 陈希妍 , 等 银杏叶提取物注射液对重症急性 胰腺炎患者炎症介质的影响 J 新乡医学院学报 , 2013, 30 (11 :92

35、1-9236栾正刚 , 郭仁宣 重症急性胰腺炎大鼠 HMGB1对肠上皮细胞 Occludin 表达的影响 J 中华急诊医学杂志 , 2012, 21(10 : 1093-10987unkelN S , Moody F G , Smith G S , et al The role of the gut in the development of sepsis in acute pancreatitis J J Surg es, 1991, 51(1 :18-23(下转第 397页 液时也可显示心脏向对侧移位 , 但胸腔内可见大量 无回声区分布及压缩的肺组织 。 回顾分析本组先天 性膈疝病例的超声

36、诊断报告及随访结果 , 发现其较 难与 CCAM 进行鉴别诊断 , 但通过上述鉴别诊断要 点及定期复查 、 动态随访 , 在一定程度上可以提高疾 病诊断的准确率 。结合本组病例的临床资料结果 , 表明胎儿先天 性膈疝的预后很差 。 但随着超声诊断技术及宫内介 入治疗技术的不断发展 , 临床产科医师越来越关注 膈疝胎儿的预后及宫内治疗 。 近年来 , 国外学者在 先天性膈疝的预后评估方面做了大量的研究 , 普遍 认为 , 无其他合并畸形和染色体异常的单纯性左侧 膈疝在出生后立即行修补术 , 其预后较好 。 临床研 究发现膈疝的主要致死原因为肺发育不良导致的呼 吸衰竭 , 所以产前超声检出膈疝的时

37、间 、 膈疝类型以 及是否合并其他畸形等因素对于胎儿的预后有重要 意义 。 近年文献报道对先天性膈疝患儿运用超声检 查技术来评估预后的最新方法主要包括通过健侧 肺 /头围比值 7-8、 肺的三围容积 9、 肺动脉多普勒 参数 10以及吸氧对肺动脉血流频谱的影响等 , 可间 接判定肺功能 。 Jani 等 11研究显示 , 通过测量健侧 肺的面积与胎儿头围的比例 (lung to head circumfer-ence ratio , LH 以及健侧肺的质量与胎儿体质量之 比 (lung-to-body weight ratio , LBW 2项指标来评估 胎儿肺部发育情况 , 在左侧膈疝中运用

38、 LH可以较 好地评估胎儿肺发育不良的程度 , 并且 LH与 LB-W有较好的相关性 ; 而在右侧膈疝中此方法评估 结果相关性较差 10。随着科技的发展 , 产前超声对于先天性膈疝的 诊断应包括疾病的检出 、 膈疝的分型 、 相关疾病的鉴 别诊断及预后的评估等方面 。 检查中采用胎儿胸 、 腹腔横切面连续扫查及多角度 、 多切面观察方法 , 有 助于 胎 儿 先 天 性 膈 疝 的 检 出 。 同 时 孕 妇 在 妊 娠 22 26周做 1次系统的产前超声筛查非常重要 , 并 且对疑似或高危人群有必要追踪检查 , 以避免漏诊 、 误诊 。参考文献 :1李伟燎 , 蒋学武 , 李建宏 , 等 先

39、天性膈疝患儿围手术期处理 J 实用儿科临床杂志 , 2010, 25(8 :610-6122陈常佩 围生期超声多普勒诊断学 M 北京 :人民卫生出版 社 , 2002:211-2143Graham G , Devine P CAntenatal diagnosis of congenital diaphrag-matic hernia J Semin Perinatol , 2005, 29(2 :69-764孔秋英 , 谢红宁 妇产科影像诊断与介入治疗学 M 北京 :人 民卫生出版社 , 2001:160-1615李胜利 胎儿畸形产前超声诊断学 M 北京 :人民军医出版 社 , 2004:2

40、51-2566施卫平 彩色多普勒超声诊断隔离肺 J 中国优生与遗传杂 志 , 2012, 20(10 :103-1047Hedrick H L , Denzer E , Merchant A , et al Liver position and lung-to-head ratio for prediction of extracorporeal membrahe oxygenation and survival in isolated left congenital diaphragmatic hernia J Am J Obstet Gynecol , 2007, 197(4 :422, e1-e48Jani J , Nicolaides K H , Keller L , et al Observed to expected lung area to head circumference ratio in the predict ion of survival in fe-tuses with isolated diaphragmatic herni-a J Ultrasound O