桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA的提取及PCR反应体系优化_图文

1、2009; 35(2 蚕业科学CAN Y E KEXUE 收稿日期:2008-03-26资助项目:河北省强势特色学科桑天牛成虫肠道细菌多样性研究项目(编号2008013 。作者简介:袁秀洁(1982- , 女, 河北, 硕士研究生。通讯作者:李会平, 博士, 副教授。黄大庄, 教授, 博士生导师。桑天牛成虫肠道细菌基因组D NA 的提取及PCR 反应体系优化袁秀洁李会平黄大庄黄秋娴苏筱雨侯晓杰(河北农业大学, 河北保定071000摘要为了建立一套适用于桑天牛肠道细菌多样性研究的PCR 反应体系和程序, 采用改良的十六烷基三乙基溴化铵(CT AB 法提取桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA, 通过L

2、16(45 正交组合试验和单因素梯度试验对MgCl 2、d NTP 、随机引物、Taq DNA 聚合酶、模板DNA 的浓度和退火温度、循环次数等影响PCR 扩增的重要因素进行优化。试验结果表明, 采用改良的CT AB 方法提取的桑天牛成虫肠道细菌DNA , 适宜于。25LPCR 反应体系及反应程序中各因素优化组合为:10Buffer 215200随机引物0148mol/L,Taq DNA 聚合酶0175U, 模板DNA , 关键词桑天牛; ; 中图分类号. . B 文章编号0257-4799(2009 02-0379-05m i c DNA Extracti on and Optim i za

3、ti on of PCR Reacti onSyste m of Apriona germ a ri I ntesti n al Bacter i aY UAN Xiu 2J ie L I Hui 2Ping 3HUANG Da 2Zhuang 3HUANG Q iu 2XianS U Xiao 2Yu HOU Xiao 2J ie(H e b e i A g ric u ltu ra l U n ive rs ity, B a od ing H e b e i 071000, C h ina A b s tra c t In o rd e r to e s ta b lis h op ti

4、m a l PCR (p o lym e ra s e c ha i n re a c ti on s ys tem a nd p roc e d u re fo r s tud ying the d ive rs ity of Ap riona g e r m a ri in te s ti na l b a c te ria, a m od ifi e d C T AB (he xa d e c yl tri m e thyl am m on ium b rom i d e m e thod w a s em p l oye d to e xtra c t g e nom ic DNA o

5、f the Ap riona g e r m a ri i n te s tina l b a c te ria. S e ve ra l i m p o rta n t fa c to rs i nc lud ing M gC l 2, dN TP, ra nd om p rim e r, Ta q p o lym e ra s e a nd tem p la te DNA w e re op ti m i ze d th roug h L 16(45o rthog ona lly d e s i g ne d e xp e ri m e n t . A nne a li ng tem p

6、e ra tu re a nd num b e r of am p lific a ti on c yc l e s w e reop ti m ize d th roug h s i ng le fa c to r e xp e ri m e n t . The re s u lts s how e d tha t h ig h q ua lity g e nom ic DNA c ou ld b e ob 2ta i ne d fo r PCR a na l ys e s b y the m od i fie d C T AB m e thod. The op ti m a l re a

7、c tion s ys tem fo r PCR a na lys i s w a s a s fo llow s:a to ta l vo lum e of 25L PCR re a c tion m i xtu re c on ta i n i ng 215L of 10b uffe r, 210m m o l/Lof M gC l 2, 012m m o l/Lof dN TP, 0148m o l/Lof ra nd om p ri m e r, 0175U of Ta q p o l ym e ra s e, 75ng of tem p l a te DNA, a nd a nne

8、a ling tem p e ra tu re a s 60fo r 30c yc le s of am p lifi c a tion.Ke y w o rd s Ap riona g e r m a ri ; In te s ti na l b a c te ria l g e nom ic DNA; PCR re a c tion s ys tem ; O rthog ona l c om b i na 2tion; S ing l e fa c to r昆虫肠道存在大量微生物, 其中大部分为细菌。这些肠道微生物通过微生态调节而影响到昆虫的生命活动, 因此与昆虫的免疫能力和营养取食之间存

9、在密切的关系。近年来, 微生物生态学的研究日趋完善, 对于以昆虫肠道微生态和肠道微生物研究为核心的害虫防治方法的探索也已成为研究的热点之一。随着现代分子生物学技术在微生物培养中的广泛应用, 又为微生物生态学的研究和利用开辟了新的技术途径。973桑天牛(A priona ger m ari 属鞘翅目昆虫, 是多种林木、果树、花卉的主要蛀干害虫, 也是近年来我国危害最严重、最难防治的林木害虫之一1。目前关于桑天牛的防治研究主要集中于利用白僵菌以及卵寄生蜂的生物防治等方面2-8, 而从微生物生态学和分子生物学角度研究桑天牛肠道细菌, 探索桑天牛防治的新途径却鲜见报道。基因组DNA 提取及PCR 扩增

10、是利用分子生物学技术研究肠道微生物的前提, 因此本试验以微生物生态学为理论基础, 对桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA 的提取方法以及PCR 反应条件进行了探索, 旨在建立一套适用于利用分子生物学技术方法研究桑天牛肠道细菌多样性的PCR 反应体系及反应程序。111111111试验材料2008年79月从河北农业大学标本园捕获桑天牛成虫, 饥饿过夜后放入75%乙醇溶液中浸泡3m in 杀死, 在无菌条件下取出虫体并放在011%二氯化汞溶液中消毒2m in, 移入灭菌水中清洗3次, 然后进行无菌解剖, 取出肠道, 置于-20保存备用。11112主要试剂引物、Taq DNA 聚合酶、和DL 2000lad

11、der marker 购于上海生工生物工程技术服务有限公司, d NTP 、goldvie w 和琼脂糖购于北京钧尧伟业生物技术中心, 十六烷基三乙基溴化铵(CT AB 购于北京夏新生物技术有限公司。112试验方法11211桑天牛肠道细菌基因组DNA 提取取出1条保存备用的桑天牛成虫肠道, 放入研钵中, 加入少量液氮进行冷冻研磨。研磨后装入115mL 离心管中, 加入1mL CT AB 提取缓冲液, 涡旋振荡器上震荡混匀5s 。65水浴1h, 期间每隔20m in 轻轻摇匀数次。水浴后使之冷却至室温, 用大口径枪头进行分装。然后加入等体积的V (酚 V (氯仿 V (异戊醇 =25241混合液

12、, 轻轻摇匀, 10000r/min 离心10m in, 用大口径枪头吸取上清液于另一新离心管中。按照上一步骤重复抽提23次, 直到水相和有机相交界处不再有白色沉淀物。在上清液中加入1/10体积的3mol/LNaAc (pH =512 和2倍体积冰冷100%乙醇, 轻弹或翻转混匀, 置于-20冰箱中沉淀10m in 。12000r/min 离心15m in, 弃上清液。沉淀中加入70%乙醇1mL , 000r/min 离心3m 15m in 。然515L 和L , 37水浴1h 溶解DNA 并去除RNA , -20冰箱中保存备用。11212PCR 反应体系的正交组合优化设计采用L 16(45正

13、交试验设计, 在25L 反应体系中, 设计Mg 2+浓度、dNTP 浓度、Taq DNA 聚合酶含量、引物浓度、模板DNA 质量5因素4水平(表1 16个组合(表2 。引物选用细菌通用引物(27f:52G AG AGT 2TTG AT CCTGGCTCAG 23, 由上海生物工程有限公司合成。设计PCR 扩增的基本反应程序为:95预变性2m in; 94变性30s, 60退火1m in,72延伸4m in, 共30次循环; 72延伸10m in 。PCR 产物在115%琼脂糖凝胶上进行电泳, 采用DL2000DNA ladder 分子量标准, 在紫外凝胶成像系统下观察并照相。11213PCR

14、反应程序的单因素优化设计以上述方法选取的最优组合为反应体系, 对PCR 反应程序中的退火温度和循环次数进行单因素梯度优化筛选, 并分析比较这2个因素对扩增条带清晰度的影响。退火温度设计58、60、63、654个梯度; 循环次数设计25、30、35次3个梯度。表1PCR 反应体系正交组合各因素水平设计Table 1O rthogonal design of five fact ors at four levels for PCR reacti on syste m水平Level 因素Fact orMg 2+浓度/(mmol L -1 Mg 2+concentrati ondNTP 浓度/(mmo

15、l L -1 dNTP concentrati on引物浓度/(mol L -1Pri m er concentrati onTag 酶含量/UTag poly merasecontent模板DNA 质量/ngTe mp late DNA1310012001561125100表2PCR 反应体系的L 16(45 正交组合设计试验方案Table 2Experi m ental sche me of orthogonally designed PCR reacti on syste m 编号No 1Mg 2+浓度/(mmol L -1 Mg 2+concentrati ondNTP 浓度/(mmo

16、l L -1 dNTP concentrati on引物浓度/(mol L -1 Pri m er concentrati onTag 酶含量/U Tag poly merasecontent 模板DNA 质量/ngTe mp late DNA3100108014011001002结果与分析211桑天牛肠道细菌基因组DNA 的提取效果用“11211”所述改良CT AB 法提取桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA 的凝胶电泳图谱完整性较好, 条带整齐明亮, 无拖尾现象(图1 , 说明所提取的DNA 纯度较高, 适合用于PCR 扩增。 泳道1、2分别为同一DNA 样品的2个重复Lanes 1and 2:

17、T wo repeats of the sa me DNA sa mp le图1桑天牛成虫肠道细菌基因组D NA 的凝胶电泳图谱Fig . 1The results of genom ic DNA extracti on fr omA priona ger m ari intestinal bacteria212正交组合优化的桑天牛肠道细菌基因组DNA PCR 反应体系从图2可见, 不同组合的PCR 扩增结果存在一定的差异, 在这16个正交组合设计的PCR 反应体系中, 组合1、6、16的扩增条带最少或无, 组合11、12扩增出的条带很暗而且模糊, 组合2、9、13所扩增的条带稍亮但仍较模糊,

18、 组合3、4、5、7、8、14、15扩增条带较亮; 而组合10的扩增带最亮, 并且清晰整齐, 效果最好, 为最优组合。因此确定PCR 最优反应体系(25L 为:10Buffer 215L, MgCl 2210mmol/L,d NTP 012mmol/L,随机引物0148mol/L,Taq DNA 聚合酶0175U, 模板DNA 75ng 。213单因素优化的PCR 反应程序最佳退火温度和循环次数从图3显示的PCR 反应程序的退火温度优化试验结果可见:58时扩增条带较模糊; 60时扩增出的条带清晰并且整齐, 扩增产物的量最大; 但随着退火温度的升高, 扩增产物的量变得不稳定, 条带也不清晰。从图

19、4显示的PCR 反应程序的循环次数优化试验结果可见:25次循环扩增的产物量少, 条带模糊; 30次循环扩增产物量多, 条带清晰整齐; 循环次数增加到35次时扩增产物的量减少, 条带出现模糊现象。基于上述试验结果, 筛选出桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA PCR 最优反应程序为:952m in; 9430s ; 601m in, 724m in, 30个循环; 7210m in。 M 为DL2000ladder 分子质量标准; 泳道162M. DL2000ladder marker; Lanes 1t o 16are corres t 图2D Fig . 2Electr the of m bact

20、eria fr om orthogonally designed experi ment M. DL2000ladder 分子质量标准1-4. 退火温度分别为58、60、63和65M. DL2000ladder marker1-4. Annealing te mperature of 58, 60, 63and 65res pectively图3优化退火温度的PCR 结果Fig . 3The op ti m izati on results of annealing te mperaturein PCR reaction M. DL2000ladder 分子质量标准1-3. 循环次数分别为25

21、、30和35次M. DL2000ladder marker 1-3. 25, 30and 35cycles res pectively图4优化循环次数的PCR 结果Fig . 4The op ti m izati on results of nu mber of a mp lificati oncycle in PCR reacti on3讨论本试验以微生物生态学为理论基础, 利用分子生物学技术对桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA 的提取方法进行了改良, 利用正交组合试验和单因素梯度试验对基因组DNA PCR 反应体系及反应程序进行了优化, 试验结果可为研究桑天牛肠道细菌多样性和探索基于微生物生态

22、学的桑天牛防治新方法提供技术参考。基因组DNA 提取和PCR 扩增只是桑天牛肠道细菌多样性研究的部分基础试验步骤, 进一步的研究仍需进行变性梯度凝胶电泳、DNA 测序、分析等大量后续试验工作。本试验对桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA 的提取参照郭冬生等9、吴红萍等10的方法, 并针对桑天牛肠壁组织及蛋白等杂质较多的特点, 对研磨、DNA 提纯及RNA 去除等步骤加以改良, 主要有以下几点:(1 用液氮进行快速冷冻研磨, 使研磨更充分并保证基因组DNA 不因高温而降解; (2 用酚/氯仿/异戊醇溶液抽提时, 先用等体积的Tris 2平衡酚抽提23次, 然后用酚/氯仿/异戊醇溶液抽提1次, 最后再用

23、氯仿/异戊醇溶液抽提1次, 这样有效去除了蛋白和肠道组织等杂质, 保证了DNA 具有较高的纯度; (3 整个过程避免剧烈震荡, 且在抽提时采用大口径枪头, 以保证DNA 的完整性; (4 由于每次提取都会出现大量RNA, 所以加大了RNase 的用量, 然后37水浴1h 以上, 有效去除了RNA 并使DNA 充分溶解。PCR 反应体系中每一个因素的改变均对扩增条带产生不同程度的影响:模板DNA 作为靶基因, 其用量与纯度是PCR 成败的关键因素之一; d NTP 和引物的量随着反应的进行会不断减少; 底物d NTP 浓度过高会导致聚合酶错误的掺入, 浓度过低又会影响合成效率11; Taq DN

24、A 聚合酶活性是决定反应成功与否的直接因素, 对扩增片段亮度有显著影响, 要保持其活性需要一定的离子环境,Mg 2+浓度过高, 反应特异性就会降低,Mg 2+浓度过低则会降低Taq DNA 聚合酶的活性, 从而影响反应的产物量。PCR 反应体系中各因素之间存在一个动态的适合浓度比例, 因此取得好的PCR 结果需要各个因素之间的相互优化组合。本试验对PCR 数进行了单因素优化, 温度是控制, 温度过高或过低, 都会影响扩增效率。本试验结果表明, 退火温度在60时, 扩增效果最佳。由于循环次数的增加会造成非特异性产物的增加, 所以选定其它反应参数以后再进行循环次数的摸索是比较合理的。循环次数在理论

25、上主要取决于模板DNA 的浓度, 2030个循环即可使PCR 产物量达到最大值。本试验结果表明, 30个循环的扩增产量即可满足本实验进行后续研究的要求。参考文献(References 1李会平, 黄大庄, 杜绍华, 等. 白僵菌经不同基质传代后对桑天牛幼虫的侵染力比较J .蚕业科学, 2008, 34(2 :339-3412许平, 孙孝龙. 桑天牛发生规律与防治对策J .中国蚕业,2007, 28(1 :24-263黄大庄, 刘辉芳. 桑天牛卵长尾啮小蜂的繁殖生物学研究J .林业科学, 2005, 41(2 :195-2014袁芳芳, 黄大庄, 王志刚, 等. 桑天牛卵啮小蜂基因组DNA 的提

26、取及RAP D 反应体系的优化J .蚕业科学, 2006, 32(4 :582-5855李会平, , 杜邵华, 等. J .农药学, 2008, 10(2 221-J .中, 2003, 24(4 :30-317李继泉, 杨元, 王树香, 等. 桑天牛卵长尾啮小蜂的寄主选择定位行为J .昆虫学报, 2007, 50(11 :1122-11288王晓红, 纪惠芳, 黄大庄, 等. 桑天牛幼虫感染白僵菌后的组织病理学研究J .蚕业科学, 2008, 34(1 :18-239郭冬生, 孙亮先, 张巧利, 等. 一种高质量蜂蜜核酸的快速提取方法J .泉州师范学院学报, 2005, 23(4 :85-8910吴红萍, 郑服丛. 不同环境中土壤微生物总DNA 的提取与纯化J .广西农业科学,