最全的RNA提取与RT-PCR实验步骤以及注意事项

1、在彳N Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获彳导RNA病毒基因时，会用到 RNA提取和RT-PCR技术。真核生物的基因组是 DNA,为什么不直接从 DNA PCR得到我们需要的基因呢？因为真核生 物的基因含有大量的非编码区，称为内元(intron),真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元(exon)。真核生物的 DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接， 去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA,由mRNA再翻译成蛋白质。所以，如果直接从真核生物的基因组 DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白 的思路是行不通的，因为获取的

2、DNA里面会含有非编码区。要表达真核生物的基因并表达 出相应的蛋白，只能通过提取其 mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。1 .RNA的提取RNA的提取其实原理很简单： 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。1.1 分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的 RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑 制剂，如EDTA或SDS RNA的质量决定了你能够转录到 cDNA上的序列信息量的最大值。 一般的RNA纯化方法是使

3、用异硫氟酸月瓜/酸性酚的一步法。一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始板是总 RNA还是poly(A)+ RNA, 都可以检测到扩增结果。另外，分离 poly(A)+RNA会导致样品间 mRNA丰度的波动变化，从 而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+RNA会增加检测的灵敏度。1.2 RNA提取的最大影响因素-RNA酶在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于 RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如 煮沸、高压灭菌等，RNA酶催化的反应一般不需

4、要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以 RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。外源性的 RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分 子生物学实验中使用的 RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、 塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的 RNA 酶。1.3 常用的RNA酶抑制剂* 焦碳酸二乙酯（DEPC :是一种强

5、烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和 RNA酶的活性基团组氨酸的咪陛环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。* 异硫氟酸月瓜：目前被认为是最有效的 RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使 RNA酶失活。 它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对 RNA酶有强烈的变性作用。* 氧钮核糖核昔复合物：由氧化锂离子和核昔形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制 RNA酶的活性。* RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。* 其它：SDS尿素、硅藻土等对 RNA

6、酶也有一定抑制作用。1.4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准备的工作* 尽可能在实验室专门辟出RNA操作区，离心机、移液器、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。* 操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌 以及人体自身分泌的 RNase带入各种容器内或污染用具。尽量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不仅常常给操作带来不便，而且塑料手套的多出部分常常将器具有RNase处传递到RNase-free扩大污染。* 尽量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如避反、tips、tubes等，以防交叉污染。例如， 从事RNA探针工作的研究

7、者经常使用 RNase H T1等，在操作过程中极有可能造成 移液器、 离心机等的污染。而这些污染了的器具是 RNA操作的大敌。* 关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等。多数厂家供应的无菌塑料制品很少有 RNase污染，买来后可直接用于 RNA操作。用DEPC等处理的塑 料制品，往往由于二次污染而带有 RNase,从而导致实验失败。* 所有的玻璃器皿均应在使用前于180c的高温下干烤6hr或更长时间。* 无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干、次,这样通常可以消除RNase的活性。* 配制溶液用的乙醇、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂。* 塑

8、料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故 不能使用）。* 有机玻璃的电泳槽等， 可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗， 乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室温10min,然后用0.1% DEPCR冲洗，晾干。* 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC在37c处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPG不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22科砒膜过滤除菌。1.5 RNA提取的一般步骤RNA提取的一般步骤是：破碎组织一分离RNZ 沉淀RNZ 洗涤RNZ 融解RNZ 保存RNA破碎组织和灭活 RNA酶可以同步进行，可以

9、用盐酸月瓜、硫鼠酸月瓜、NP-40、SDS蛋白酶K等破碎组织，加入 ,ME可以抑制RNA酶活性。分离RNA 一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA 一般分布于上层，与蛋白层分开。沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc (pH-5.2)或异丙醇。洗涤RNA使用70%乙醇洗涤，有时，为避免 RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾 干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。融解RNA 一般使用TE保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含 RNase的样品(如胰脏、肝脏)中分离到的 RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。

10、从大鼠肝脏中提取的 RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量 RNase的降解比小转录 本更敏感。为了增加贮存 RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70C。用于保存 RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的 RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用 RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M , 12,000 X离心 5 分钟。1.6 RNA抽提新方法 -TRIZOLMTRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞

11、时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的 的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化 DNA对于样品间标准化 RNA的产量十分有用。TRIZOL是有毒物，接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤，一旦接触皮肤后立即以大量的洗 涤剂和清水清洗。TRIZOL室温下能用I定保存 12个月。尽管如此，为达到最佳效果，建议 保存在2-8°的勺环境下。2.RT-PCRRT-PCR是指将逆转录(Reverse Tran

12、scription; RT)反应和 PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法。2.1 RT-PCR的原理RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速 灵敏的方法。RT- PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基 因表达差异或不必构建 cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括 Northern印迹、RNase保 护分析、原位杂交及 S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总 RNA或poly（A）+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录

13、酶，以随 机引物、oligo（dT）或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进 行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行 PCR在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆 转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。2.2 RT-PCR的步骤在冰浴离心管里面加入模板 RNA 4uL,引物2uL,去离子水5uL,混匀，离心3-5秒；70度水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；加入5次应液4uL, RNase抑制剂1uL, dNTP 2uL （这些应该先配好

14、，然后分再装到每一 管），混匀；37度水浴5分钟，加入1uL AMV-RT反转录酶，混匀；37度水浴1小时（此步是反转录过程）；70度10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70度保存。2.3 RT-PCR的引物设计RT-PCR引物设计和一般 PCR引物设计可以遵循同样的原则。细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。设计理想的引物都有以下共同的特点，而设计失败的引物则各有各的缺点：* 典型的引物18到24个核昔长。引物需要足够长，保

15、证序列独特性，并降低序列存在于非 目的序列位点的可能性。但是长度大于24核昔的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。* 选才i GC含量为40%到60%或GC含量反映模板 GC含量的引物。* 设计5'端和中间区为 G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。* 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。* 避免3末端富含GG设计引物时彳证在最后 5个核昔中含有3个A或T。* 避免3'末端的错误配对。3'端核昔需要同模板退火以供 聚合酶催化延伸。*

16、避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物 5'端而不影响特异性。当计算引物 Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构 的检测。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20C。以大于10dM浓度溶于TE的引物在-20C可以稳定保存 6个月，但在室温（15c至ij 30C）仅能保存不到 1周。 干粉引物可以在-20C保存至少1年，在室温（15c至IJ 30 C）最多可以保存 2个月。2.4 引物退火温度引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50%的引物和互

17、补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以 保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。 合理的退火温度从55c至ij 70 Co退火温度一般设定比引物的Tm低5C。根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异 性。开始低于估算的 Tm 5C,以2c为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引 物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5

18、C,就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物 Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5C。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行 5个循环，然后再根据较低 Tm设计的退火温度进 行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。2.5 提高逆转录保温温度较高的保温温度有助于 RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65c保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。 然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。较高的保温温度也可以

19、增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时。如果使用 GSP,确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60 C时使用oligo（dT）和随机引物。随机引物需要在增加到 60c前在25c保温10分钟。除了使用 较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65 c变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的 2刈勺反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防 止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR义可以简化RTPC刖需的多种温度切换。2.6 促进逆转录的添加剂包括甘油和 DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定

20、并解开 RNA二级结构，最多可以加入 20%的甘油或10%的DMSO而不影响或MMLV的活性。AMV 也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10 %的甘油并在45 c保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到 PCR中，那 甘油在扩增反应中的浓度为0.4%,这不足以抑制 PCR在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase蛋白RNase抑制剂仅防止R

21、Nase A, B, C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase使用无RNaseH活性（RNaseH）的逆转录酶：逆转录酶催化 RNA转化成cDNA,不管是M-MLV 还是AMV,在本身的聚合酶活性之外,都具有内源 RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活 性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA: DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的 RNA模板不能再彳为合成 cDNA的有效底物，降 低了 cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益

22、。RNaseH的MMLV逆转录酶及 RNaseH的AMV,比MMLV和AMV能得到更多量和更多全长。 RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。RPCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的 cDNA时。RNaseH的逆转录酶可以显著提高长RTPCR产物的产量，同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42 C的温度下进行。2.7 RNaseH 处理在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的 RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板

23、时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了或 AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RTPCR反应，RNaseH处理是可选的，因为 95c保温的PCR变性步骤一般会将 RNA: DNA复合物中的 RNA水解掉。2.8 小量RNA检测方法的提高当仅有小量RNA时，RTPCR尤其具有挑战性。在 RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有 助于增加小量样品的产量。 可以在加入Trizol的同时加入无 RNase的糖元。糖元是水溶性的， 可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为 25

24、0 d g/ml。2.9 一步法同两步法 RTPCR的比较两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法 RT-PCR具有其他优点。一步法 RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA,这是因为整个 cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR 一般使用反义的基因特异性引物起始 cDNA合成。2.10 增加RPCR特异性第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成 cDNA的量和种类。随机引物法是三种方法

25、中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的 RNA模板获得cDNA。为了获得最长的 cDNA,需要按经验确定每个 RNA样品中引物与 RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20 d反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的 cDNA主要是核糖体 RNA,所以模板一般选用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。 它同大多数真核细胞 mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。 因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2%,所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对 RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20d反应体系使用0.5 pg oligo(dT)oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR ThermoScript RT-PCR System供了 oligo(dT)20 ,因为其热稳定性较好， 适用于较高的保温温基因特异性引物(GSP对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核甘，可以特异性地同RNA