探讨转基因显微注射中的基因装液方法改良

1、探讨转基因显微注射中的基因装液方法改良<        摘要：目前常用的转基因动物制备方法有显微注射法、逆转录病毒感染法、精子载体法、胚胎干细胞介导法、人工酵母染色体法及电转移法等16。其中显微注射仍是最可靠、最广泛使用的一种方法,因其外源基因整合效率高,对目的基因无大小限制,且可以直接获得纯系78，但其过程烦琐且要求严格,将基因液装入微注射针是其成功的关键前提910。当前各实验室普遍使用可编程微量注射仪,该仪器要求将基因液面倒吸至注射针的直管部以获得稳定平衡压力,但仅用其吸入功能无法达到,导致培养液倒吸,基

2、因液被稀释,从而大大影响了转基因成功率。笔者建立一种简单有效的方法以克服这一缺点。 关键词：  动物 遗体修饰 小鼠 转基因 显微注射 基因转移技术1  材料与方法1.1  仪器和材料  PN30拉针仪,MF900煅针仪,IM300可编程微量注射仪（日本Narishige公司）；倒置显微镜,显微操作仪（日本Olympus公司）,G100薄壁毛细玻璃管（1×90 mm,日本Narishige公司）或BJ40        【内容导航】   

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4、#160;      原核显微注射法制备转基因小鼠是一个严格而烦琐的过程,其中将基因液装入注射针是显微注射之前必不可少的关键一步。目前完成该步骤的方法有3种：针背虹吸法、针背填充法以及针尖倒吸法。前2种方法均需要特殊的毛细管,且操作过程中极容易污染基因液,每次操作基因液的用量大,成本较高。而针尖倒吸法是利用可编程微量注射仪的“FILL”功能将基因液直接从注射针针口倒吸进入注射针。该法将基因液从针口倒吸进入注射针,既不需要使用昂贵的微载管,且每次只须<1 L的基因液,可以很大程度地节约基因液的用量；另外,每次吸取少量基因液做成基因液滴的方法

5、可以很大程度地保持基因液的纯度,在操作过程中也不会对基因液造成污染。因此,使用倒吸法装载基因液是最经济、简便的一种方法。3.1  A法的缺陷  笔者使用A法进行转基因动物实验的过程中发现,按压“FILL”按键,当液面上升到注射针尖细部一定位置后,再按压“FILL”按键多次,注射针内液面没有明显变化,表明A法不能通过人为控制吸入足够量的基因液。装好基因液的注射针下降进入培养液后,在显微镜下可以观察到针内液面缓慢下降,说明显微注射仪提供的平衡压力能够抵消培养液的虹吸效应,产生使基因液缓慢外流的正压。而在模拟显微注射过程中,连续按压数次显微注射仪的“INJ”和“CLR”键后,在注

6、射仪提供的平衡压力不变的情况下,针内液面开始缓慢上升,说明原来的平衡压力已经不能抵消虹吸效应,使得培养液倒吸进入注射针,从而稀释针内的基因液,影响转基因动物制备的成功率。注射针的内径越小,其虹吸效应就越强,当基因液液面处于针的尖细部时,随着注射过程进行,液面不断向针尖方向移动,抵消虹吸效应所需的平衡压力就越高,这就需要在注射过程中时时调节“BALN”的压力,这既增加了显微注射的困难度,而且实际上也不大可能实现。并且,使用该法仅能倒吸入少量基因液,在注射过程中,需要经常按压“CLR”键（10次）来保证注射针口的通畅,在这个过程中会损失大量的基因液,导致吸入的基因液不足以完成一盘受精卵（2030个

7、）的注射量,增加了装载基因液的频率,亦会大大影响转基因实验的成功率。3.2  B法的改良  本实验采用先从注射针背部装入适量石蜡油的方法（即B法）解决以上问题。在基因液装载的过程中发现,按压“FILL”按键数次,石蜡油与基因液的交界面仍然可以上升,表明B法可以通过增加“FILL”的次数来装入足够量的基因液,以保证顺利完成一盘受精卵的注射,从而节约注射时间。而在模拟显微注射过程中,连续按压数次显微注射仪的“INJ”和“CLR”键后,在注射仪提供的平衡压力不变的情况下,针内液面仍然缓慢下降,这说明只要石蜡油的上液面仍然处于注射针的直管部,即使基因液面在细管部移动,仍然不会影响抵

8、消虹吸效应所需的平衡压力,因此连续按压数次显微注射仪的“INJ”和“CLR”键后,原来设定的平衡压力仍然能够产生使基因液缓慢外流的正压,消除了压力不稳定给转基因动物实验带来的影响因素。此外,由于石蜡油稳定、无毒、非亲水的特性,已被广泛应用于细胞培养的实验中,相对于高度提纯的基因液来说,石蜡油更加经济且易于获得。由于石蜡油的非亲水性,在基因液后端装上石蜡油可以防止溶液蒸发导致基因浓度升高,保持基因注射过程中基因液的正常浓度。且由于该操作的简便、无菌,在显微注射过程中可以重复装载基因液,毋需更换新的注射针,减少注射针使用量。用于装载石蜡油的微载管可以反复使用,也减少其用量。【参考文献】 

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