中药成分测定方法

1、1第四章第四章 中药的含量测定中药的含量测定 2第一节第一节 含量测定的目的与意义含量测定的目的与意义 中药的含量测定与化药有很大区别中药的含量测定与化药有很大区别中药组成复杂，产生疗效的不是某单一成分，中药组成复杂，产生疗效的不是某单一成分，检测检测任何一种活性成分均不能反映中药的整体疗效任何一种活性成分均不能反映中药的整体疗效。但是借鉴化药质量控制模式，测定某一味药味的有但是借鉴化药质量控制模式，测定某一味药味的有效成分、活性成分、指标性成分的含量的方法，对效成分、活性成分、指标性成分的含量的方法，对于于控制中药质量起着不可替代的重要作用控制中药质量起着不可替代的重要作用。通过测定中药中有

2、效成分、毒性成分或某些指标性通过测定中药中有效成分、毒性成分或某些指标性成分的含量来成分的含量来衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的衡量其制剂工艺的稳定性和中药材的质量优劣质量优劣，以保证中药的质量，达到临床用药安全、，以保证中药的质量，达到临床用药安全、有效的目的。有效的目的。 3第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 样品处理的主要作用有：样品处理的主要作用有： 将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于将被测成分有效地从样品中释放出来，并制成便于分析测定的稳定试样。分析测定的稳定试样。 除去杂质、纯化样品，以提高分析方法的重现性和除去杂质、纯化样品，以提高分析方法的重现性和准确

3、度。准确度。 富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成分。富集浓缩或进行衍生化，以测定低含量被测成分。衍生化不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的衍生化不仅可提高检测器的灵敏度，还可以提高方法的选择性。选择性。 使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求。使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求。 4第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 一、样品的粉碎一、样品的粉碎 1.1.目的目的：W 是保证含量测定所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的是保证含量测定所取样品均匀而有代表性，提高测定结果的精密度和准确度；精密度和准确度；W 是使样品中的被测组分能更快地完全提取出来。是使样品中

4、的被测组分能更快地完全提取出来。2.2.粉碎时粉碎时注意事项注意事项：S 不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成不要粉碎得过细。样品粉碎得过细，在样品提取时，会造成过滤困难，因此可视实际情况进行粉碎过筛。过滤困难，因此可视实际情况进行粉碎过筛。S 避免污染样品。在粉碎样品时，要尽量避免由于设备的磨损避免污染样品。在粉碎样品时，要尽量避免由于设备的磨损或不干净等原因而玷污样品，或不干净等原因而玷污样品，S 防止粉尘飞散或挥发性成分的损失。防止粉尘飞散或挥发性成分的损失。 过筛时，通不过筛孔的部分颗粒决不能丢弃，必须反复粉碎过筛时，通不过筛孔的部分颗粒决不能丢弃，必须反复粉碎或碾磨，

5、让其全部通过筛孔。或碾磨，让其全部通过筛孔。5第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 二、样品的提取二、样品的提取 对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适对于中药材和固体制剂样品，在粉碎后，取粉末适量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和某些量精密称定，首先用溶剂进行提取，使被测组分和某些共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣共存组分从中溶解出来（前者必须完全溶出），与滤渣分离后，再对被测组分进行含量测定。分离后，再对被测组分进行含量测定。常见的提取方法常见的提取方法：Y 冷浸法冷浸法 Y 回流提取法回流提取法 Y 连续回流提取法连续回流提取法 Y 超声提取法超

6、声提取法 Y 超临界流体提取法超临界流体提取法6第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 三、样品的分离净化三、样品的分离净化 （一）沉淀法（一）沉淀法（二）蒸馏法（二）蒸馏法 （三）液一液萃取法（三）液一液萃取法（LLELLE）（四）色谱法（四）色谱法 7第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 （四）色谱法（四）色谱法 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱皆可作为中药制剂分析中的净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱药制剂分析中的净化分离方法，其操作方式有柱色谱，薄层色谱和纸色谱。和纸色谱。 其中经典微柱色谱

7、，也称固相萃取或液其中经典微柱色谱，也称固相萃取或液固萃取（固萃取（LSELSE）具有）具有设备简单，使用方便，快速，净化效率较高而最常用，将在此做设备简单，使用方便，快速，净化效率较高而最常用，将在此做一简介。一简介。 LSELSE通常是指样品溶液加到装有合适固定相（净化剂）的长通常是指样品溶液加到装有合适固定相（净化剂）的长5515cm15cm，内径，内径0.50.51cm1cm的色谱柱中，将被测成分保留于柱上，的色谱柱中，将被测成分保留于柱上，洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定，或者是使杂质强烈保留洗去杂质后，再洗脱被测成分进行测定，或者是使杂质强烈保留于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。

8、用这种选择性好而柱效较于柱上，直接洗脱被测成分进行测定。用这种选择性好而柱效较低的方法进行样品的净化分离，尤其适用于一类总成分的含量测低的方法进行样品的净化分离，尤其适用于一类总成分的含量测定，也可将色谱柱流出的样品进一步用定，也可将色谱柱流出的样品进一步用GCGC、HPLCHPLC、TCLTCL分离后测定。分离后测定。 LSELSE的常用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、的常用净化剂（填料）有氧化铝、氧化镁、硅藻土、硅胶、活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶活性炭、大孔树脂离子交换树脂、键合相硅胶C8C8、C18C18、聚酰胺等。、聚酰胺等。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子

9、交换型填料。视其性质可分为亲脂型、亲水型和离子交换型填料。 8第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 硅胶、氧化铝等：硅胶、氧化铝等： 它们是传统的吸附剂，多以它们是传统的吸附剂，多以0.070.070.15mm0.15mm(200(200100100目目) )的的颗粒颗粒1 15g5g用于样品的净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂用于样品的净化处理，其作用机制为溶质在吸附剂表面的极性吸附作用。通常是当表面的极性吸附作用。通常是当溶于有机溶剂的样品溶于有机溶剂的样品加到柱上加到柱上时非极性或时非极性或低极性的杂质先被洗出低极性的杂质先被洗出色谱柱，再用适当极性的溶色谱柱，再用适当极性

10、的溶剂洗脱被测成分，而强极性的杂质仍保留在柱上。剂洗脱被测成分，而强极性的杂质仍保留在柱上。 氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等的测氧化铝能将黄酮类吸附在柱上，用于生物碱、苷类等的测定。例如用法（吸收系数法）定。例如用法（吸收系数法） 硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。硅胶适合于分离中性或酸性化合物，强烈保留碱性化合物。若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大的溶剂洗脱，若把样品提取液加到柱上，依次用极性由小到大的溶剂洗脱，则可以将杂质和被测成分分离。则可以将杂质和被测成分分离。9键合相硅胶：键合相硅胶： 十八烷基键合相硅胶（简称十八烷基键合相硅胶（简称C18C

11、18或或ODSODS）是常用的固体萃取）是常用的固体萃取剂，其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性剂，其次有烷基、苯基、氰基键合相硅胶，可用来分开脂溶性和水溶性杂质或成分。也常用于萃取，纯化水基质体液中憎水和水溶性杂质或成分。也常用于萃取，纯化水基质体液中憎水性药物。该类性药物。该类LSELSE的一般操作程序为：的一般操作程序为：1)1)柱的活化。用柱的活化。用2ml2ml甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用甲醇冲洗以润湿键合相和除去杂质，再用0.50.5毫升水洗去柱中的甲醇。毫升水洗去柱中的甲醇。2)2)上样。上样。3)3)清洗。用清洗。用2 25ml5ml的的水水清洗以清洗以除

12、去弱保留的亲水成分除去弱保留的亲水成分，如无机盐、，如无机盐、氨基酸、亲水的蛋白质、糖以及中等保留成分的极性化合物、氨基酸、亲水的蛋白质、糖以及中等保留成分的极性化合物、低肽等。低肽等。4)4)洗脱。用洗脱。用2 25ml5ml甲醇或甲醇甲醇或甲醇- -水洗脱水洗脱大分子的肽、甾体、较亲脂大分子的肽、甾体、较亲脂的药物等强保留的待测组分。的药物等强保留的待测组分。 第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 10大孔树脂：它可分为极性和非极性型大孔树脂：它可分为极性和非极性型 极性极性 丙烯酰胺聚合物丙烯酰胺聚合物; ; 非极性非极性 苯乙烯和二乙烯苯的共聚物苯乙烯和二乙烯苯的共聚物.

13、 . 其吸附性质与烷基键合相硅胶相似，通过疏水作用其吸附性质与烷基键合相硅胶相似，通过疏水作用对非极性水溶性成份有吸附力。例如在测定复方归芪剂对非极性水溶性成份有吸附力。例如在测定复方归芪剂中的黄芪甲苷时，用大孔树脂除去水溶性的多糖杂质，中的黄芪甲苷时，用大孔树脂除去水溶性的多糖杂质，再用再用30%30%乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂的主要特点是表乙醇洗脱黄芪甲苷。大孔树脂的主要特点是表面积极大，传质速率较高和具有不同的极性及适于吸附面积极大，传质速率较高和具有不同的极性及适于吸附较大分子。较大分子。 树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等树脂在使用前需要前处理：用甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂

14、除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该填料用有机溶剂除去杂质，有时还需用酸、碱清洗。该填料用量常为量常为1 12g2g，有时也用，有时也用100100150mg150mg来萃取血、尿中药来萃取血、尿中药物，操作程序类似物，操作程序类似ODSODS填料。填料。 第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 11第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 聚酰胺：聚酰胺： 它是常用的有机吸附剂，主要通过与它是常用的有机吸附剂，主要通过与溶质形成氢键而产生吸附作用。溶质形成氢键而产生吸附作用。 常用于含酚、酸、醌类药物样品液的常用于含酚、酸、醌类药物样品液的净化分离，净化分离， 如测定黄酮

15、时，用样品的乙醇提取液如测定黄酮时，用样品的乙醇提取液上柱，水洗去部分杂质，以上柱，水洗去部分杂质，以95%95%乙醇洗脱总乙醇洗脱总黄酮后测定。黄酮后测定。 12第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 硅藻土、纤维素：硅藻土、纤维素： 它们为常用的亲水型填料，其原理为分配它们为常用的亲水型填料，其原理为分配作用。填料作为支持剂，多以水基质液作为作用。填料作为支持剂，多以水基质液作为固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相，固定相，与水不混溶的有机溶剂为流动相，较亲脂的成分从固定相转移到流动相，而被较亲脂的成分从固定相转移到流动相，而被洗脱，达到萃取的目的。其萃取率较高（一洗脱，达到萃

16、取的目的。其萃取率较高（一般大于般大于80%80%），无浓集作用，萃取液较纯净，），无浓集作用，萃取液较纯净，但洗脱剂用量较大（一般大于但洗脱剂用量较大（一般大于5ml5ml） 硅藻土柱则用干柱直接上样，柱可再生。硅藻土柱则用干柱直接上样，柱可再生。常见牌号为常见牌号为ExtretutExtretut。纤维素柱的使用与硅。纤维素柱的使用与硅藻土柱相似。藻土柱相似。 13离子交换树脂：离子交换树脂： 憎水基质的离子交换树脂兼有离子交换憎水基质的离子交换树脂兼有离子交换剂及大孔树脂的一些性质，所以对于在水中剂及大孔树脂的一些性质，所以对于在水中溶解度不大的药物、洗脱剂中需含一定量的溶解度不大的药物

17、、洗脱剂中需含一定量的有机溶剂。有机溶剂。 离子交换树脂柱可用于除去样品中的离离子交换树脂柱可用于除去样品中的离子，防止组分分解，更常用于萃取样品液中子，防止组分分解，更常用于萃取样品液中可离解化合物。可离解化合物。第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 14第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 此外，近年来发展起来的固相微此外，近年来发展起来的固相微萃取萃取(Solid-Phase microextraction, (Solid-Phase microextraction, SPME)SPME)和液相微萃取和液相微萃取(Liquid- Phase (Liquid-

18、Phase microextraction,LPME)microextraction,LPME)技术有良好技术有良好的应用前景。的应用前景。SPMESPME是一种无溶剂的萃是一种无溶剂的萃取技术，取样方式有直接取样和顶空取技术，取样方式有直接取样和顶空取样。取样。15（五）消化法五）消化法 对样品进行有机破坏，常用于中药制剂中重金属的检查。对样品进行有机破坏，常用于中药制剂中重金属的检查。 常用的破坏方法有湿法消化和干法消化法。常用的破坏方法有湿法消化和干法消化法。 湿法消化：根据所用试剂不同，下面介绍三种常见的消湿法消化：根据所用试剂不同，下面介绍三种常见的消化方法。化方法。 （1 1）硝酸

19、）硝酸高氯酸法高氯酸法 该法破坏能力强，反应较激烈，故该法破坏能力强，反应较激烈，故进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中的溶液蒸干，以免发进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中的溶液蒸干，以免发生爆炸。本法适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制生爆炸。本法适用于血，尿、组织等生物样品和含动植物药制剂的破坏，经破坏后所得无机金属离子均为高价态，本法对含剂的破坏，经破坏后所得无机金属离子均为高价态，本法对含氮杂环类有机物破坏不够完全。氮杂环类有机物破坏不够完全。 （2 2）硝酸）硝酸硫酸法硫酸法 该法适用于大多数有机物质的破坏，该法适用于大多数有机物质的破坏，无机金属离子均氧化成高价态，与硫酸形

20、成不溶性硫酸盐的金无机金属离子均氧化成高价态，与硫酸形成不溶性硫酸盐的金属离子的测定，不宜采有此法。属离子的测定，不宜采有此法。 第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 16第二节第二节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理 （3 3）硫酸）硫酸硫酸盐法硫酸盐法 本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入本法所用硫酸盐为硫酸钾或无水硫酸纳，加入硫酸盐的目的是为了提高硫酸的沸点，以使样品破硫酸盐的目的是为了提高硫酸的沸点，以使样品破坏加速完全。同时防止硫酸在加热过程中过早地分坏加速完全。同时防止硫酸在加热过程中过早地分解为解为SO3SO3而损失。经本法破坏所得金属离子，多为而损失。经本

21、法破坏所得金属离子，多为低价态。本法常用于含砷或锑的有机样品的破坏，低价态。本法常用于含砷或锑的有机样品的破坏，破坏后得到三价砷或锑。破坏后得到三价砷或锑。 湿法消化所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃湿法消化所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐制成的凯氏瓶（直火加热）或聚四氟乙烯消化罐（烘箱中加热）。所用试剂应为优级纯，水应为去（烘箱中加热）。所用试剂应为优级纯，水应为去离子水或高纯水，同时必须按相同条件进行空白实离子水或高纯水，同时必须按相同条件进行空白实验校正。操作时应在通风橱内进行。验校正。操作时应在通风橱内进行。 17第二节第二节 含量测定样品的处理

22、含量测定样品的处理 干法消化干法消化 本法是将有机物灼烧灰化以达分解的目的，将适量样品置本法是将有机物灼烧灰化以达分解的目的，将适量样品置于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水于瓷坩锅、镍坩锅或铂坩埚中，常加无水Na2CO3Na2CO3或轻质或轻质MgOMgO等以等以助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高助灰化，混匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全即可。本法不适用于含易挥发性金温炉中灼烧，使其灰化完全即可。本法不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等，）有机样品的破坏。属（如汞、砷等，）有机样品的破坏。 应用本法时要注意以下几个问题：应用本法时要注意以

23、下几个问题： 1 1）加热灼烧时，控制温度在）加热灼烧时，控制温度在420420以下，以免某些被测金以下，以免某些被测金属化合物的挥发。属化合物的挥发。 2 2）灰化完全与否，直接影响测定结果的准确度。如欲检查）灰化完全与否，直接影响测定结果的准确度。如欲检查灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量的稀灰化是否完全，可将灰分放冷后，加入稍过量的稀HCl-HCl-水（水（1:31:3）或硝酸或硝酸- -水（水（1:31:3）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于）溶液，振摇。若呈色或有不溶有机物，可于水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。水浴上将溶液蒸干，并用小火炭化后，再行灼烧。 3 3

24、）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。去。18第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法 | 分类重量分析和滴定分析。分类重量分析和滴定分析。| 化学分析法所用仪器简单，结果准确。化学分析法所用仪器简单，结果准确。| 主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及主要用于测定制剂中含量较高的一些成分及含矿物药制剂中的无机成分，如总生物碱类、总含矿物药制剂中的无机成分，如总生物碱类、总酸类、总皂苷及矿物药制剂等。酸类、总皂苷及矿物药制剂等。| 化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，化学分析法有一定的局限性，其灵敏度低，操作繁琐、耗时长

25、，专属性不高，对于微量成分操作繁琐、耗时长，专属性不高，对于微量成分准确性不理想。准确性不理想。19第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）重量分析法（一）重量分析法 重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。重量法可分为挥发法、萃取法和沉淀法。 1 1、挥发法可测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质、挥发法可测定具有挥发性或能定量转化为挥发性物质的组分含量。如：的组分含量。如：供试品的干燥失重测定；供试品的干燥失重测定；水分测定均属水分测定均属挥发法；挥发法；中药制剂分析中灰分及炽灼残渣的测定等。中药制剂分析中灰分及炽灼残渣的测定等。 2 2、萃取法是根据被测组分在互不相溶的两相中溶解

26、度的、萃取法是根据被测组分在互不相溶的两相中溶解度的不同，达到分离的目的。如不同，达到分离的目的。如冰硼散中冰片的含量测定；冰硼散中冰片的含量测定；地地奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；奥心血康胶囊中甾体总皂苷含量测定；昆明山海棠片中总生昆明山海棠片中总生物碱的含量测定；物碱的含量测定；甘草浸膏中甘草酸的含量测定即采用萃取甘草浸膏中甘草酸的含量测定即采用萃取法。法。 3 3、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其、沉淀法是将被测组分定量转化为难溶化合物，测定其含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。如含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。如西瓜霜润喉西瓜霜润喉片中西瓜霜的含量测定；片

27、中西瓜霜的含量测定；苦参片中苦参总碱的含量测定；苦参片中苦参总碱的含量测定；复方元胡注射液总碱的测定。复方元胡注射液总碱的测定。 20第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（二）滴定分析法二）滴定分析法 滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法滴定分析法分为酸碱滴定法、沉淀滴定法、配位滴定法和氧化还原滴定法。和氧化还原滴定法。 1 1、酸碱滴定法、酸碱滴定法 适用于测定中药制剂中所含有的生物碱、有机酸、内酯适用于测定中药制剂中所含有的生物碱、有机酸、内酯类等酸、碱组分的含量。类等酸、碱组分的含量。 直接滴定：对于直接滴定：对于KC10KC10-8-8的酸、碱组分，可在水溶液的酸

28、、碱组分，可在水溶液中直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱的含量测定、颠中直接滴定。如：止喘灵注射液中总生物碱的含量测定、颠茄酊中生物碱的含量测定。茄酊中生物碱的含量测定。 间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质的间接滴定或非水滴定法：如大山楂丸中总酸性物质的含量测定、草乌注射液中生物碱的含量测定等。含量测定、草乌注射液中生物碱的含量测定等。2 2、沉淀滴定法、沉淀滴定法 主要用于生物碱、生物碱的氢卤酸盐及含卤素的其他有主要用于生物碱、生物碱的氢卤酸盐及含卤素的其他有机成分的含量测定。机成分的含量测定。21第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法3 3、配位滴定法、配位滴定法 包括

29、包括EDTAEDTA法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，法和硫氰酸铵法，在中药制剂分析中，用以测定鞣质、生物碱及含用以测定鞣质、生物碱及含Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+、Fe3+Fe3+、Hg2+Hg2+等矿物类制剂的含量。如等矿物类制剂的含量。如万氏牛黄清心丸等万氏牛黄清心丸等的含量测定就采用硫氰酸铵法；的含量测定就采用硫氰酸铵法；牛黄解毒片中石牛黄解毒片中石膏的含量测定。膏的含量测定。4 4、氧化还原滴定法、氧化还原滴定法 适用于测定具有氧化还原性的物质，如含酚类、适用于测定具有氧化还原性的物质，如含酚类、糖类及矿物药糖类及矿物药FeFe、AsAs等成分的中药制剂。如等成分的中药制剂。如

30、磁朱磁朱丸中全铁的含量测定采用铈量法；丸中全铁的含量测定采用铈量法；牛黄解毒片中牛黄解毒片中雄黄的含量测定；雄黄的含量测定；丹皮酚注射液中丹皮酚的含量丹皮酚注射液中丹皮酚的含量测。测。 22第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法二、可见一紫外分光光度法二、可见一紫外分光光度法 该法是中药及其制剂含量测定的一种常该法是中药及其制剂含量测定的一种常用方法用方法, ,具有灵敏度高，精度好和操作简便具有灵敏度高，精度好和操作简便等优点。等优点。 该法要求被测成分本身或其显色产物对该法要求被测成分本身或其显色产物对可见可见紫外光具有选择性吸收。按测定波长紫外光具有选择性吸收。按测定波长数目不同分

31、为单波长光谱法和多波长光谱法。数目不同分为单波长光谱法和多波长光谱法。 23第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）单波长光谱法（一）单波长光谱法 分类分类方法方法特点特点吸收系数法吸收系数法测定所配供试品溶液在规定波长的吸测定所配供试品溶液在规定波长的吸收度，根据被测成分的吸收系数收度，根据被测成分的吸收系数（E E1%1%1cm1cm）计算其含量）计算其含量对仪器要求高，使用该法时，对仪器要求高，使用该法时，应注意仪器波长、空白吸收的应注意仪器波长、空白吸收的校正，吸收度准确度的检定和校正，吸收度准确度的检定和杂散光的检查杂散光的检查无需对照品，方法简便无需对照品，方法简便对照

32、品比较法对照品比较法在同样条件下配制对照品溶液和供试在同样条件下配制对照品溶液和供试溶液，且使前者中所含被测成分的量溶液，且使前者中所含被测成分的量应为后者中被测成分的量的应为后者中被测成分的量的100%100%10%10%，用规定波测定二者的吸，用规定波测定二者的吸收度，则可计算出供试品中被测成分收度，则可计算出供试品中被测成分的浓度或含量的浓度或含量对仪器要求较高对仪器要求较高标准曲线法标准曲线法配制一系列不同浓度的对照品溶液配制一系列不同浓度的对照品溶液（常为（常为5 5个），在相同条件下分别测个），在相同条件下分别测定吸收度，绘制定吸收度，绘制A-CA-C曲线，或求出其曲线，或求出其回

33、归直线方程（相关系数回归直线方程（相关系数r0.999r0.999），），即得标准曲线。在相同条件下，测定即得标准曲线。在相同条件下，测定供试品溶液的吸收度，就可求得供试供试品溶液的吸收度，就可求得供试品中被测成分的浓度或含量。品中被测成分的浓度或含量。本法对仪器的精度要求不高，本法对仪器的精度要求不高，有时标准曲线不通过原点，只有时标准曲线不通过原点，只要重现性好也可使用要重现性好也可使用该法在比色法中最常用该法在比色法中最常用24第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（二）多波长光谱法（计算分光光度法）（二）多波长光谱法（计算分光光度法） 供试品溶液中若有多种（两种或两种以上）供试

34、品溶液中若有多种（两种或两种以上）组分共存，其紫外光谱彼此发生不同程度的重叠组分共存，其紫外光谱彼此发生不同程度的重叠时，则可通过测定多种波长处的吸收度，根据吸时，则可通过测定多种波长处的吸收度，根据吸收度的加和性，采用适当的数学处理方式进行多收度的加和性，采用适当的数学处理方式进行多组分的同时测定，或者用其排除共存组分干扰，组分的同时测定，或者用其排除共存组分干扰，测定其中的某个组分。这就属于多波长光谱法的测定其中的某个组分。这就属于多波长光谱法的范畴。范畴。 下面简要介绍用多波长法测定存在光谱干扰下面简要介绍用多波长法测定存在光谱干扰的多组分样品中某个组分的一些技术：的多组分样品中某个组分

35、的一些技术：双波长法双波长法（包括等吸收点法和系数倍率法）、三波长法、（包括等吸收点法和系数倍率法）、三波长法、导数光谱法和差示光谱法等。导数光谱法和差示光谱法等。 25第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法优点是可省去或简化样品预处理步骤，测定组成已知的复优点是可省去或简化样品预处理步骤，测定组成已知的复杂样品，但是使用该法应慎重。杂样品，但是使用该法应慎重。 首先因为中药及其制剂的供试品溶液往往组成复杂，首先因为中药及其制剂的供试品溶液往往组成复杂，甚至干扰组分或阴性空白样品的变动性大，因此，使得其甚至干扰组分或阴性空白样品的变动性大，因此，使得其方法的适应性差，而只适应于同批样品

36、或内控应用，目前方法的适应性差，而只适应于同批样品或内控应用，目前很少在药典和新药报批中使用多波长法作为中药制剂含量很少在药典和新药报批中使用多波长法作为中药制剂含量测定方法。测定方法。 再者，当测定的吸收度处在吸收曲线的陡峭部位时，再者，当测定的吸收度处在吸收曲线的陡峭部位时，波长的微小变动可能对测定结果造成显著的偶然误差。波长的微小变动可能对测定结果造成显著的偶然误差。 还有在实际工作中，由于测试条件的变化，仪器精度还有在实际工作中，由于测试条件的变化，仪器精度与性能的限制，多波长法不用吸收系数法，而采用标准品与性能的限制，多波长法不用吸收系数法，而采用标准品对比的方法（常用标准曲线法）来

37、进行样品的测定。对比的方法（常用标准曲线法）来进行样品的测定。 26第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法三、薄层扫描法三、薄层扫描法 薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来的薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱的记录的薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱的记录方法，又称薄层色谱扫描法（方法，又称薄层色谱扫描法（TLCS），相应仪），相应仪器称为薄层扫描仪（器称为薄层扫描仪（Thin Layer Chromatogram Scanner）。）。 薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见

38、光的斑点，上，对薄层色谱中吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质检查或含量测定。检查或含量测定。27第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）基本原理（一）基本原理 薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，描，薄层色谱扫描是指固定波长，斑点移动，测定测定A-lA-l或或F-lF-l曲线。根据薄层扫描的测定方曲线。根据薄层扫描的测定方式分为式分为薄层吸收扫描法薄层吸

39、收扫描法和和薄层荧光扫描法薄层荧光扫描法二二种方法。种方法。28第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法1 1、薄层吸收扫描法、薄层吸收扫描法 基本原理：基本原理：Kubelka-MunkKubelka-Munk理论及曲线。由于薄层板存在理论及曲线。由于薄层板存在明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用Kubelka-MunkKubelka-Munk理论及曲线来描述。理论及曲线来描述。Kubelka-MunkKubelka-Munk理论以斑点理论以斑点的相对的相对反射率反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度，说和相对透光率计

40、算薄层色谱斑点的吸光度，说明了固定相的散射参数明了固定相的散射参数SXSX对斑点中物质的浓度与吸光度间关对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响，获得不同散射参数系的影响，获得不同散射参数SXSX时斑点的时斑点的A-KXA-KX理论曲线，即理论曲线，即Kubelka-MunkKubelka-Munk曲线。曲线。 光源：钨灯和氘灯；光源：钨灯和氘灯； 灵敏度：在灵敏度：在200-800nm200-800nm波长范围内选择合适波长进行测波长范围内选择合适波长进行测定，其灵敏度可达定，其灵敏度可达ngng级；级； 适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通适用范围：适用于在可见、紫外区有吸收的物

41、质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。292 2、薄层荧光扫描法、薄层荧光扫描法 基本原理：基本原理：F=2.3KIF=2.3KI。ECLECL或或F=KCF=KC 光源：氙灯或汞灯。光源：氙灯或汞灯。 灵敏度：最低可测到灵敏度：最低可测到10-50pg10-50pg。 适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理适用范围：适合于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定。后可产生荧光的物质的测定。 Kubelka-MunkKubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直。用薄层荧光

42、扫描进行定量分析时，用进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强度的积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组斑点荧光强度的积分值（色谱峰峰面积）与斑点中组分的含量代替上式中分的含量代替上式中F F与与C C 进行运算。进行运算。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法30（二）薄层色谱的规范化操作（二）薄层色谱的规范化操作1 1、仪器与材料、仪器与材料薄层板；薄层板；涂布器；涂布器；点样器材；点样器材；展开箱展开箱（层析缸）（层析缸）显色与检测仪器显色与检测仪器2 2、操作方法、操作方法薄层板的制备；薄层板的制备；点样；点样；展开；展开；检测；检测；第三节第三节 常用定量分析方法常

43、用定量分析方法31第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（三）定量分析方法（三）定量分析方法1 1、方法学考察、方法学考察 新建薄层扫描定量方法必须进行方新建薄层扫描定量方法必须进行方法考察，以说明新建方法的可靠性，考法考察，以说明新建方法的可靠性，考察的内容有工作曲线、定量结果的精密察的内容有工作曲线、定量结果的精密度及准确度、统计检验等内容。度及准确度、统计检验等内容。32（1 1）工作曲线）工作曲线 检查所选择的散射参数检查所选择的散射参数SXSX值是否适宜。值是否适宜。SXSX值适宜则工值适宜则工作曲线被校直为直线，否则，调整作曲线被校直为直线，否则，调整SXSX值再校正，直至

44、在一定值再校正，直至在一定点样量范围内工作曲线成直线为止。点样量范围内工作曲线成直线为止。 考察工作曲线是否过原点，以便确定采用一点法或二考察工作曲线是否过原点，以便确定采用一点法或二点法定量。点法定量。 确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直，也只是确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直，也只是在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的在一定点样量范围内工作曲线为直线，因此需确定点样量的上、下限。上、下限。 为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品为降低定量误差，最好调整点样量，使供试品与对照品的峰面积相接近。的峰面积相接近。 为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采用随

45、行为了克服薄层板间差异，外标法及内标法均应采用随行标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。标准法，即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上。 第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法33第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（2 2）精密度考察）精密度考察 取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以取同一供试品溶液，在同一块薄层板上以相同点样量平行点相同点样量平行点5 5点以上，展开后测定其峰点以上，展开后测定其峰面积，求算相对标准差（面积，求算相对标准差（RSDRSD），作为衡量定），作为衡量定量分析结果精密度的指标。量分析结果精密度的指标。RSDRSD应小于应小于

46、4%4%。 式中：为式中：为n n次测量的平均值，次测量的平均值，S S为标准差。为标准差。%100(%) XSRSD34第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（3 3）准确度考察）准确度考察 回收率是衡量定量方法准确度的指标，常用回收率是衡量定量方法准确度的指标，常用加样回收率（加样回收率（R R）来衡量，其值应在）来衡量，其值应在95-105%95-105%之间，之间，测量数据一般为测量数据一般为5-65-6个。个。 将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，溶液点于同一块薄层板上，展开后进行薄层扫描，测

47、定各斑点的峰面积，计算各溶液中组分的量，测定各斑点的峰面积，计算各溶液中组分的量，计算回收率（计算回收率（R R）。）。加加入入纯纯品品量量供供试试品品中中被被测测组组分分量量加加入入纯纯品品后后测测得得总总量量100% R35（4 4）统计检验）统计检验 统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量统计检验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量的两组实验数据的精密度或准确度（偶然误差或系统误的两组实验数据的精密度或准确度（偶然误差或系统误差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代差）间是否存在显著性差异，说明新建定量方法可否代替旧方法或优于旧方法。替旧方法或优于旧方法。 统计检验包括统计

48、检验包括F F检验与检验与t t检验。检验。 F F检验检验即精密度差别检验，用以检验两组数据的精即精密度差别检验，用以检验两组数据的精密度或偶然误差是否存在显著性差异，一般为单侧检验。密度或偶然误差是否存在显著性差异，一般为单侧检验。 t t检验检验即准确度差别检验，用以检验两组测量数据即准确度差别检验，用以检验两组测量数据的平均值或系统误差是否存在显著性差异。若的平均值或系统误差是否存在显著性差异。若t t检验证检验证明两种方法测得的均值不存在显著性差异时，则新方法明两种方法测得的均值不存在显著性差异时，则新方法可以代替旧方法，可以代替旧方法，t t检验一般为双侧检验。检验一般为双侧检验。

49、 t t检验与检验与F F检验的具体方法参见分析化学的有关论著，检验的具体方法参见分析化学的有关论著，此从略。此从略。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法36第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法2 2、定量方法、定量方法 常用的定量方法有常用的定量方法有外标法外标法、内标法内标法、追加法追加法（叠（叠加法）及加法）及回归曲线回归曲线定量法。定量法。（1 1）外标法）外标法 外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法，方法外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法，方法简便，但点样必须准确。简便，但点样必须准确。外标一点法外标一点法 工作曲线通过原点（截距为零）时可用外标一点工作曲线通过

50、原点（截距为零）时可用外标一点法定量。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同法定量。只需点一种浓度的标准品溶液，与供试液同板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：板展开，对比，测定组分含量，其计算公式为：C=FC=F1 1AA 式中：式中：C C为组分的重量或浓度，为组分的重量或浓度，A A为测得该组分的为测得该组分的峰面积，峰面积，F1F1为直线的斜率或比例常数。为直线的斜率或比例常数。37外标二点法外标二点法 工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量，工作曲线不通过原点时，只能用外标二点法定量，至少需点二种不同浓度的标准溶液（或一种浓度两种点至少需点二种不同浓度的标准溶液（或一种浓度两

51、种点样量），才能决定一直线样量），才能决定一直线, ,其计算公式为：其计算公式为：C=FC=F1 1A+FA+F2 2 式中：式中：C C、A A同前，同前，F F1 1为直线的斜率或比例常数，为直线的斜率或比例常数，F F2 2为纵坐标的截距，为纵坐标的截距，F F1 1和和F F2 2值由仪器自动算出。值由仪器自动算出。 外标一点法、二点法只是指用一种或二种浓度的标准溶液对比外标一点法、二点法只是指用一种或二种浓度的标准溶液对比定量，为减小误差，同一薄板上定量，为减小误差，同一薄板上供试品点样不得少于供试品点样不得少于4 4个个，对照品对照品每一浓度不得少于每一浓度不得少于2 2个个；并调

52、整标淮溶液的浓度或供试品与标准溶；并调整标淮溶液的浓度或供试品与标准溶液的点样量，使其峰面积相接近；且点样量必须准确，宜用定量毛液的点样量，使其峰面积相接近；且点样量必须准确，宜用定量毛细管点样细管点样。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法38第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（2 2）内标法）内标法 内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称内标法是选一个纯物质作为内标物，并准确称取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试取一定量内标物加至供试液及标准液中，计算供试品溶液中某组分含量的定量方法。品溶液中某组分含量的定量方法。 内标物的选择要求是：内标物的选择要求是：Z

53、纯度合乎要求，展开后不得有杂质斑点，否则内纯度合乎要求，展开后不得有杂质斑点，否则内标斑点的峰面积将不能代表内标物的量。标斑点的峰面积将不能代表内标物的量。Z 内标物须为样品中所不含有的成分。内标物须为样品中所不含有的成分。Z 内标物不与其它斑点相重叠，分离度合乎要求。内标物不与其它斑点相重叠，分离度合乎要求。Z 为简化计算，内标物在标准溶液及供试品溶液中为简化计算，内标物在标准溶液及供试品溶液中的浓度应相等。的浓度应相等。39特点：特点： 1 1）在一定点样量范围内，内标法定量准确度与点样量无关。）在一定点样量范围内，内标法定量准确度与点样量无关。 2 2）不易找到适宜）不易找到适宜RfRf

54、值的纯品内标物，且溶液配制等操作较值的纯品内标物，且溶液配制等操作较麻烦。麻烦。方法：方法： 1 1）内标一点法：当工作曲线通过原点时采用内标一点法。）内标一点法：当工作曲线通过原点时采用内标一点法。内标一点法公式：内标一点法公式： 2 2）工作曲线不通过原点时必须采用内标二点法）工作曲线不通过原点时必须采用内标二点法内标二点法公式：内标二点法公式： 式中：式中：C C、CisCis分别为组分及内标物的浓度或重量，分别为组分及内标物的浓度或重量，A A、AisAis分分别为测得组分及内标物的峰面积，别为测得组分及内标物的峰面积，F1F1为直线的斜率或比例常数，为直线的斜率或比例常数，F2F2为

55、截距，为截距，F1F1和和F2F2由仪器自动计算并内存，可直接给出样品的浓由仪器自动计算并内存，可直接给出样品的浓度或重量。度或重量。isisAAFCC1 21FAAFCCisis 第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法40（3 3）回归曲线定量法）回归曲线定量法 将不同浓度（或不同量）的标准溶液与供将不同浓度（或不同量）的标准溶液与供试液点在同一块薄层板上，展开、扫描试液点在同一块薄层板上，展开、扫描; ; 由计算机对所测得的峰面积及相应点样量由计算机对所测得的峰面积及相应点样量进行线性或非线性回归进行线性或非线性回归; ; 直接由回归方程或回归曲线计算供试液含直接由回归方程或回归曲

56、线计算供试液含量的方法量的方法; ; CAMAG CAMAG系列薄层扫描仪即采用此方法。系列薄层扫描仪即采用此方法。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法41第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（四）影响薄层色谱分析的主要因素（四）影响薄层色谱分析的主要因素1 1、样品的预处理及供试液的制备、样品的预处理及供试液的制备2 2、薄层色谱的点样技术、薄层色谱的点样技术3 3、吸附剂的活性与相对湿度的影响、吸附剂的活性与相对湿度的影响4 4、溶剂蒸气在薄层色谱中的作用、溶剂蒸气在薄层色谱中的作用5 5、温度的影响、温度的影响42相对湿度（相对湿度（% %）所需硫酸浓度（所需硫酸浓度

57、（V/VV/V）硫酸（硫酸（mlml）水（水（mlml）3232686810010042425757100100585839.539.510010065653434100100727227.527.5100100888810.810.88989控制相对湿度用的硫酸溶液控制相对湿度用的硫酸溶液第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法43第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法四、气相色谱法四、气相色谱法 气相色谱法是以气体为流动相的柱色谱分离气相色谱法是以气体为流动相的柱色谱分离分析方法。分析方法。 特点：分离效能高、选择性好、灵敏度高，特点：分离效能高、选择性好、灵敏度高，样品用量

58、少及分析速度快等特点，兼具分离、分样品用量少及分析速度快等特点，兼具分离、分析的功能，适用于热稳定性好的易挥发性或可转析的功能，适用于热稳定性好的易挥发性或可转化为易挥发性组分的分析。化为易挥发性组分的分析。 适用范围：适用于热稳定性好的易挥发性或适用范围：适用于热稳定性好的易挥发性或可转化为易挥发性组分的分析。可转化为易挥发性组分的分析。44第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（一）基本原理（一）基本原理 气相色谱是根据汽化后的试样被载气带入气相色谱是根据汽化后的试样被载气带入色谱柱，由于各组分在两相间作用不同，在色色谱柱，由于各组分在两相间作用不同，在色谱柱中移动有快慢，经一定柱

59、长后得到分离，谱柱中移动有快慢，经一定柱长后得到分离，依次被载气带入检测器，将各组分浓度或质量依次被载气带入检测器，将各组分浓度或质量变化转换成电信号变化记录成色谱图，利用色变化转换成电信号变化记录成色谱图，利用色谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高进行定量分析的方法。进行定量分析的方法。45第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法（二）实验条件的选择（二）实验条件的选择 在气相色谱分析中，为达到满意的分离效果，需在气相色谱分析中，为达到满意的分离效果，需依据依据Van DeemeterVan Deemeter方程式和分离度方程式选择合适的方程

60、式和分离度方程式选择合适的分离条件，主要有固定相、柱温、载气流速等条件的分离条件，主要有固定相、柱温、载气流速等条件的选择。选择。 1 1、固定相的选择、固定相的选择 1 1）气）气液色谱液色谱 固定液：按极性相似、化学官能团相似的固定液：按极性相似、化学官能团相似的相似相似性原则性原则和主要差别选择。和主要差别选择。 载体：一般为适宜粒度，经酸洗并硅烷化处理载体：一般为适宜粒度，经酸洗并硅烷化处理的硅藻土。的硅藻土。 2 2）气）气固色谱：固定相大多采用高分子多孔微球固色谱：固定相大多采用高分子多孔微球（GDXGDX），用于分离水及含羟基（醇）化合物。），用于分离水及含羟基（醇）化合物。46