大鼠→小鼠异种骨髓移植耐受诱导的研究

1、    大鼠小鼠异种骨髓移植耐受诱导的研究        【摘要】目的探索适合临床应用的有效诱导异种骨髓移植耐受的方案。方法给亚致死照射（5Gy）的C57BL/6(B6)小鼠尾静脉注射4×107Lewis大鼠骨髓细胞,2天后腹腔注射环磷酰胺150mg/kg。分别于骨髓移植后30天、60天、90天，对受体小鼠外周血、脾脏及胸腺中的淋巴细胞进行间接免疫荧光染色，作FACS分析，检测大鼠源性的骨髓细胞在小鼠体内植活情况，并于30天后，对受体小鼠作混合淋巴细胞反应（MLR）

2、及迟发超敏反应（DTH）检查。结果经处理的B6小鼠外周血、脾脏及胸腺中检测出了大鼠源性的骨髓嵌合体,嵌合体可长期存在(>3个月)。MLR及DTH检查证明B6小鼠对Lewis大鼠的脾细胞产生特异性耐受，对无关第3者DA大鼠及BALB/c小鼠的脾细胞仍表现出强烈的免疫应答。结论在B6小鼠体内成功地诱导出了供者特异性的大鼠小鼠异种骨髓移植耐受。【关键词】嵌合体免疫耐受骨髓移植，异种 Study on the induction of xenogeneic tolerance of rat to mouse bone marrow transplantationSong Xianyuan* ,

3、Yuan Xueli, Xie Shusheng. *Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083 【Abstract】 ObjectiveTo establish an effective protocol for potential clinical usage in inducing donorspecific tolerance across xenogeneic barriers. MethodsC57BL/6 (B6) mice were conditioned with 5 Gy subl

4、ethal total body irradiation (TBI), followed by infusion of 4× 107 Lewis rat bone marrow cells on day 0, then were intraperitonially administered 150 mg/kg cyclophosphamide (CP) on day 2. Recipients were characterized for engraftment with xenogeneic bone marrow cells by using fluorescence activ

5、ated cell sorter (FACS) to determine the percentage of rat origin cells in the peripheral blood lymphocytes(PBL), splenic and thymic lymphoid cells on day 30, 60 and 90. Mixed lymphocyte reaction (MLR) and delayed type hypersensitivity (DTH) assay were performed on day 30 to examine the tolerance st

6、atus. ResultsRat lymphoid chimeras were reliable present in the tolerant B6 mice for more than 3 months. B6 recipients were specifically tolerant to host xenoantigens in MLR and DTH assays, but were still immunocompetent to MHCdisparate third party BALB/c mouse or DA rat stimulator cells. Conclusion

7、A durable rat to mouse xenogeneic bone marrow transplantation tolerance was achieved in this modal. 【Key words】 Chimerism Immunotolerance Bone marrow transplantation,xenogeneic 目前器官移植中，由于供者器官短缺的问题日益严重,异种移植(Xenotransplantation)已成为当今器官移植领域的研究热点。鉴于异种移植排斥反应强烈，而协调性（concordant）异种动物，如大、小鼠之间，不存在天然抗体，对异种移植物不

8、会发生超急排斥(HyperacuteRejection,HAR)，所以比较适合于用来研究异种移植耐受。目前这方面的研究主要在鼠类间进行。Ilstad等1曾将致死照射（9.5Gy）小鼠输入大鼠骨髓细胞(BMC)，在小鼠体内建立了大、小鼠骨髓嵌合体，使受体小鼠获得了异种移植耐受，对植入的供者组织或器官不发生排斥。我们曾在同种移植中应用输注供者骨髓和脾细胞，然后再注射单剂环磷酰胺(CTX)的方法建立了同种异基因小鼠间的深度移植耐受2。在此基础上，我们用亚致死照射联合环磷酰胺的方法成功地诱导出了大鼠小鼠供者特异的异种骨髓移植耐受。报告如下。材料和方法1动物810周龄C57BL/6(B6)小鼠及BALB

9、/c小鼠，由北京医科大学动物部提供。68周龄DA大鼠及Lewis大鼠由本室引进并繁殖。动物性别不限。2异种骨髓嵌合体模型的建立(Lewis大鼠B6小鼠)在第0天，以5GyCo源照射B6小鼠，4小时内尾静脉输入4×107大鼠骨髓细胞，第2天，部分小鼠给予腹腔内注射CTX150mg/kg；以单纯照射小鼠作对照。3异基因嵌合体的测定分别制备受体小鼠外周血、胸腺及脾脏的淋巴细胞悬液，调细胞浓度至2×107/ml，取上述细胞50l加入Eppendorff管，加入纯化的兔抗大鼠淋巴细胞抗体（本室制备）50l，置4，30分钟，PBS洗涤细胞2次，然后加入FITC荧光标记羊抗兔IgG二抗5

10、0l，置4、30分钟，PBS洗涤细胞2次，加入1ml荧光抗体保存液，置4保存,以流式细胞仪(FACScan;BectonDickinson)测定嵌合细胞含量。4迟发型超敏反应(DTH)检查于小鼠腹股沟皮下注射1×107大鼠脾细胞预致敏，7天后于右后脚掌注射1×107(50l)相同的脾细胞，左后脚掌注射50lHanks液作对照。24小时后测量两脚掌的厚度，取其差值作为DTH指标。5单向混合淋巴细胞反应(MLR)大鼠骨髓移植后,分别取大、小鼠脾脏淋巴细胞作为反应细胞和刺激细胞作单向混合淋巴细胞培养。调整细胞浓度为5×106/ml，反应细胞与经20Gy照射的刺激细胞各1

11、00l，加入96孔细胞培养板，于37、体积分数为5CO2培养箱培养72小时，每孔加入5mg/ml的MTT液10l，继续培养4小时，2000r/min离心20分钟，小心吸出上清，每孔加入100g/LSDS液100l，振荡混匀，静置4小时，使沉淀物充分溶解，在960全自动酶标仪上测吸光度A600nm值。6统计学处理数据以<"01 (888 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317175225790" 14 16>±s表示，利用Excel数据分析功能进行t检验。结果1小鼠外周血、胸腺嵌合体检查骨髓移植3

12、0天时，单纯输注骨髓的对照小鼠未检测到嵌合体的存在，经5Gy照射后进行Lewis骨髓移植（LBMT）的B6小鼠外周血、胸腺皆能查到大鼠嵌合体的存在，嵌合水平在519（1），但在移植后60天已检测不到嵌合体，而照射LBMTCTX耐受诱导组的小鼠于移植后90天仍可检测到低水平的大鼠淋巴细胞(15)，其在骨髓移植后30天、60天的嵌合水平依次为1243，925（2）。在脾脏中也查到类似结果。说明经过诱导后，B6小鼠对Lewis大鼠的骨髓细胞已产生较持久的耐受。    a:阴性对照；b:二抗对照；c:5GyLBMT;d:5GyLBMTCTX;e:阳性对照1FAC

13、S方法对不同组小鼠骨髓移植后30天外周血嵌合体检查    a:5GyLBMT组;b:5GyLBMTCTX组2FACS方法检查不同时期耐受小鼠胸腺内大鼠淋巴细胞嵌合体水2DTH结果大鼠骨髓移植60天后，照射LBMTCTX耐受诱导组（组4）B6小鼠对供者Lewis大鼠脾细胞的DTH反应仍在较低水平，其足掌胀度为(0.23±0.035)mm，较单纯照射对照组（组1）(0.76±0.09)mm及未输骨髓组（组2）（0.64±0.05)mm或未加CTX组（组3）（0.54±0.03)mm差异有显著性（P<0.01, P

14、<0.05, P<0.05） 。而组2、组3与组1比较差异无显著性（0.05）。各LBMT组小鼠对无关第3者DA大鼠的脾细胞都有正常DTH反应，各组之间差异无显著性（表1）。骨髓移植90天后重复上述实验，结果无明显变化。说明耐受是有特异性的，且随时间推移，耐受状态并未打破。表1骨髓移植后60天耐受B6小鼠对大鼠供体性DTH反应（<"01 (888 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317175225790" 14 16>±s）组别5GyCTXLBMT致敏脾细胞样本数足掌胀度（mm)1L

15、ewis60.76±0092Lewis6064±005*3Lewis6054±003*4Lewis6023±0035DA6080±0056DA6076±0067DA6079±0078DA6082±008注：*与组1比较，P>0.05;与组1，7比较P<0.01；与组2，3比较P<0.05;5，6，7，8各组间比 较 ,P>0.053MLR结果骨髓移植60天时，照射LBMTCTX耐受诱导组B6小鼠脾细胞对供者Lewis大鼠脾细胞的混合淋巴细胞反应特异性降低（P<0.01），但对无关第3者

16、DA大鼠及BALB/c小鼠的脾细胞仍有强烈的增殖反应（P<0.01）（3）。骨髓移植90天后重复上述实验，结果无明显变化。    3耐受小鼠对供体特异性MLR结果讨论1免疫排斥的种属屏障是异种移植的难题。在不协调性（discordant）的异种动物之间，由于天然抗体的存在，异种器官移植后立即发生HAR，移植物在几分钟内就可以被排斥3。目前用转基因动物，如转人衰变加速因子（Decay?acceleratingfactor,DAF）的转基因猪，通过抑制补体活化来防止HAR，已取得一定成功4，但除HAR外，迟发型异种排斥（delayedxenograft

17、rejection,DXR）以及T细胞介导的急、慢性排斥也是异种排斥的重要屏障5。研究表明，细胞介导的DXR对环孢菌素（CsA）等免疫抑制剂不敏感6，因此，诱导异种动物之间的移植耐受是解决DXR的重要方法。Ilstad等在1984年报道用致死量照射方法处理受体小鼠，然后将大鼠的BMC与同系小鼠BMC混合，输给受体小鼠（ratmousemouse），从而诱导形成了大、小鼠混合嵌合体，受体小鼠可接受供者来源的组织、器官而不发生排斥。但大剂量照射的作用过于强烈，不适用于临床，而降低照射剂量后，由于照射小鼠体内残存的外周成熟T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的移植排斥作用，植入的异种骨髓细胞不易存活。为

18、此，Sharabi等对小鼠进行亚致死量照射后，再用抗小鼠T细胞单抗（Thy?1.2），抗小鼠CD4、CD8单抗，抗NK细胞单抗（NK1.1）等一系列抑制小鼠T细胞和NK细胞功能的措施，也成功地使大鼠骨髓细胞在小鼠体内植活7,但方法较为繁琐，试剂昂贵，不易推广。为了简化诱导方案，探索有效的适合临床应用的异种移植耐受诱导的方法，我们以亚致死剂量全身照射联合单剂CTX腹腔注射进行异种骨髓移植，获得了较好的效果。2CTX是临床常用的免疫抑制药物，NK细胞及增殖细胞都对CTX敏感8。由于注入体内的异种抗原会引起相应T细胞克隆增殖，所以在LBMT2天后，腹腔注射CTX能抑制NK细胞活性，并能杀死处于增殖中

19、的T细胞克隆，造成小鼠对大鼠相应抗原的T细胞克隆大量死亡，为植入的大鼠骨髓细胞创造了建立嵌合体的条件。我们曾用这种方法，成功地诱导出跨越H?2屏障的同种异基因移植耐受9。本研究结果表明，只经亚致死量照射，单纯输入大鼠的骨髓细胞存活不能超过60天，但经CTX注射诱导耐受后就可延长90天以上。耐受小鼠对供体大鼠的MLR和DTH长期保持特异的抑制状态，而对无关第3者大鼠及小鼠的脾细胞仍有强烈的增殖反应，说明小鼠对供体大鼠组织细胞的耐受是具有特异性的。这与非特异免疫抑制有本质差别。本实验结果表明，输入的供者大鼠骨髓细胞可以在小鼠骨髓和胸腺中形成中枢嵌合体，通过胸腺选择获得中枢耐受，并可以迁移到脾脏及外

20、周血中，形成外周嵌合体，在外周耐受的形成中起重要作用10。供者大鼠的造血细胞与受体小鼠的造血细胞共存，使受体免疫系统把供者组织抗原看作为“自己”成分，从而可以接受供者的任何组织器官而不发生排斥。我们发现，虽然中枢嵌合状态已经建立，大鼠小鼠骨髓移植耐受已经形成，在骨髓移植60天，只经照射的小鼠已不存在大鼠的骨髓细胞，但此时耐受诱导小鼠体内大鼠骨髓细胞仍高达925，说明其已获得对大鼠骨髓细胞的耐受。随着时间的延长，大鼠骨髓细胞在嵌合小鼠的体内比例在逐渐降低，由于耐受小鼠对供者大鼠脾细胞的DHT及MLR反应在60天时仍然表现为特异性的耐受状态，排除了这种大鼠骨髓细胞比例降低是由于移植排斥引起的可能性

21、。研究发现，接受猪肾移植的猴子会罹患严重的贫血，说明猪红细胞生成素在猴的体内并不能很好地行使生理功能。此外，接受狒狒肝移植的人血清胆固醇水平相对较低，而且其血尿酸水平明显较正常人降低，因为狒狒的肝脏与人的不同，并不产生尿酸11。这种异种移植中由于“分子不相容性”(molecularincompatibility)引起的移植物功能障碍，也许说明小鼠的造血微环境可能并不完全适合大鼠骨髓的生长，随着时间的推移将逐渐被小鼠的骨髓造血细胞所替代。这种异种移植的种属屏障也是异种移植需要解决的重要问题。本课题受国家自然科学基金(39770699)资助作者单位：宋娴媛谢蜀生（北京医科大学免疫学系100083）

22、苑学礼（北京医科大学第一医院泌尿外科北京医科大学泌尿外科研究所）参考文献1Ilstad ST, Sachs DH. Reconstitution with syngeneic and allogeneic or xenogeneic bone marrow leads to specific acceptance of allografts or xenografts. Nature, 1984, 307: 168171. 2白爱林，谢蜀生，龙振洲.成年小鼠皮肤移植耐受诱导的实验研究.中国免疫学杂志，1994, 10: 274276. 3Parker W, Saadi S, Lin SS, e

23、t al. Transplantation of discordant xenografts: a challenge revisited. Immunology Today, 1996, 17: 373378. 4Dalmasso AP, Vercellotti GM, Platt JL, et al. Inhibition of complement? mediated endothelial cell cytotoxicity by decayaccelerating factor. Potential for prevention of xenograft hyperacute rej

24、ection. Transplantation, 1991, 52: 530534. 5Bach FH, Winkler H, Ferran C，et al.Delayed xenograft rejection. Immunology Today, 1996,17: 379384. Bach FH, Ferran MS, Wrighton C, et al. Modification of vascular responses in xenotransplantation: inflammation and apoptosis. Nature Med，1997, 3: 944948. 7Sharabi Y, Aksentijevich