药物分析课件-第四章_药物的含量测定方法

1、第四章第四章 药物的含量测定方法药物的含量测定方法 与验证与验证前言前言 药物的含量：指药物中所含主成分的量，是评价药物质量的重要指标。前言前言药物的含量测定分两类基于化学或物理学原理的含量测定。基于生物学原理的效价测定。目标基础本章的目标：含量测定。生物检定法，微生物检定法，酶法。P40：效价测定方法：凡以生物学方法或者酶学方法对药品中的特定成分以标准品为对照，作量反应平行线测定方法进行的生物活性（效力）测定。前言前言药物的含量测定第一节第一节 定量分析方法的分类与特点定量分析方法的分类与特点 一、容量分析法，亦称滴定法 定义：将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到被测药物的溶液中

2、，直至滴定液与被测药物反应完全（通过适当方法指示），然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测药物的含量。通过指示剂颜色变化 ，或者电子设备的电位或电流突变来指示滴定终点，滴定终点和计量不一致，就会引入滴定误差，应该尽量避免。一、容量分析法一、容量分析法 特点： 1.方法简便易行：所用仪器价廉易得，操作简便快速； 2.方法耐用性高：影响测定的试验条件与环境因素少； 3.测定结果准确：误差低于0.2%，满足准确度高样品； 4.方法专属性差：对相近杂质干扰缺少选择，适用于主成分含量较高的样品分析。 适用范围： 广泛应用于化学原料的测定，较少应用于药物制剂的测定。（二）容量分析法的

3、有关计算（二）容量分析法的有关计算 滴定度：每1mL规定浓度的滴定液所相当的被测药物质量。中国药典用毫克（mg）表示。（二）容量分析法的有关计算（二）容量分析法的有关计算 滴定度的计算aAbBcCdDABABWWaMbM被测药物滴定液用B滴定A被测药物反应的质量滴定液反应的质量滴定液的摩尔质量被测药物的摩尔质量（二）容量分析法的有关计算（二）容量分析法的有关计算 滴定度的计算用B滴定ABAABABBBAWaWMnMb MbamVMb滴定液待测液浓度乘体积=nB浓度mB等于1mL计算有一个从质量到物质的量，再到浓度再到滴定度的转变过程 示例一 计算Vc的滴定度T 碘量法测定Vc含量M（C6H6O

4、6）=176.13，C（I2）=0.05mol/L(/)aT mg mLmMb6862666210.05176.138.806(/)1C H OIC H OHIaTmMmg mLb （二）容量分析法的有关计算（二）容量分析法的有关计算 示例二 异烟肼的滴定度 溴酸钾法测定异烟肼含量M（C6H7N3O）=137.14，C溴酸钾=0.01667mol/L(/)aT mg mLmMb67336522232332330.01667137.14 3.429(/)2C H NOKBrOC H NONKBrH OaTmMmg mLb （二）容量分析法的有关计算（二）容量分析法的有关计算（二）容量分析法的有关

5、计算（二）容量分析法的有关计算 3.含量计算方法：直接滴定法与间接滴定法 直接滴定法% =100%VTW含量（ ） 在实际工作中，滴定液的浓度可能与药典规定的浓度并不一致，所以应该进行校正。=FF实际摩尔浓度实际摩尔浓度规定摩尔浓度规定摩尔浓度（二）容量分析法的有关计算（二）容量分析法的有关计算 直接滴定法的含量计算方法% =100%VTFW含量（ ）自己标定药典规定直接读取取样量（二）容量分析法的有关计算（二）容量分析法的有关计算（1）生成物滴定法）生成物滴定法（1）生成物滴定法）生成物滴定法 示例三 葡萄糖酸锑钠的含量测定本法先用葡萄糖酸锑钠与碘离子反应生成碘，再用碘与硫代硫酸钠反应生成碘

6、离子，相当于是用硫代硫酸钠在滴定葡萄糖锑钠，因此要找出它们两者的量反应关系，也就是a和b。 0.3g供试品+水100mL+盐酸15mL+碘化钾试液10mL密塞，振摇后暗处放置10min碘量法5-322222346b2b22SISIIS OIS OSb5+2S2O32-（1）生成物滴定法）生成物滴定法(2)剩余量滴定法剩余量滴定法(2)剩余量滴定法剩余量滴定法(2)剩余量滴定法剩余量滴定法 示例四 司可巴比妥钠的含量测定取本品约0.1g，精密称定，置250mL碘瓶中，加水10mL，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.05mol/L) 25mL，再加盐酸5mL，立即密塞，并振摇1min，在暗处放置15

7、min后，注意微开瓶塞，加碘化钾试液10mL，立即密塞，摇匀后，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定，至终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定得的结果用空白试验校正。(2)剩余量滴定法剩余量滴定法(2)剩余量滴定法剩余量滴定法 示例四 司可巴比妥钠的含量测定已知：司可巴比妥钠M=260.27；司可巴比妥钠与溴反应摩尔=1：1；W=0.1022g；硫代硫酸钠浓度校正因子=1.038；供试品滴定Vs=15.73mL；空白试验滴定Vo=23.21mL；01(/)0.05260.2713.01(/)1)% =100%SBBBAaT mg mLmMmg mLbVVFTW （含量（ ）讨

8、论讨论 在剩余量滴定法中，第一滴定液与第二滴定液的浓度是相当的。 如上例中，第一滴定液为溴滴定液（0.05mol/L），第二滴定液为硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）。 Br2I22Na2S2O3 本公式适用于空白校正情形(2)剩余量滴定法剩余量滴定法 本公式适用于没有做空白校正情形 习题一 剩余碘量法测定异烟肼含量异烟肼在弱碱性溶液中，加定量过量的碘滴定液（0.1mol/L)氧化，反应完成后，酸化，剩余碘滴定液用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L)滴定（以淀粉为指示剂）。（二）容量分析法的有关计算（二）容量分析法的有关计算 习题二 非那西丁含量测定精密称取本品0.3630g加稀盐酸回流1小

9、时后，放冷，用亚硝酸钠液（0.1010mol/L)滴定，用去20.00mL。每1mL亚硝酸钠液（0.1mol/L)相当于17.92mg的C10H13O2N，请计算非那西丁的含量。（二）容量分析法的有关计算（二）容量分析法的有关计算二、光谱分析法二、光谱分析法光谱分析法药典收载红外分光度法火焰光度法紫外可见分光度法荧光分析法原子吸收分光光度法本章讲叙紫外可见分光度法荧光分析法（一）紫外（一）紫外-可见分光光度法可见分光光度法 基于物质分子对紫外光区（波长为200400nm）和可见光区（波长为400760nm）的单色光辐射的吸收特性建立起来的光谱分析方法。 1、朗伯-比尔定律2、方法特点与适用范围

10、、方法特点与适用范围（1）简便易行：本法使用的仪器价格比较低廉，操作简单，易于普及（2）灵敏度高：本法灵敏度可达10-710-4g/mL，适用于低浓度试样分析（3）准确度较高：本法误差在2%5%之间，适用于对测定结果的准确度要求较高的样品（4）专属性较差：本法通常不受一般杂质的干扰，但对结构相近的有关物质缺乏选择性。 本法紫外区须选用石英比色皿，比色皿一般为1cm，吸光度在0.30.7之间为宜，选用最大吸收光波长。 本法比较少应用于原料药的含量测定，可用于制剂的含量测定。（1）对照品比较法）对照品比较法 分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测药物的量应为供试品溶液中被测成分规定量

11、的10010%，所用溶剂量两者相同，在规定的波长下测定吸光度。按下式计算结果：xRxRACCACx供试品溶液浓度；CR对照品溶液浓度；Ax，AR对应吸光度；（1）对照品比较法）对照品比较法 对原料药:% =100%=100%:xCDWCxDW测得量含量（ ）称样量供试品浓度；：稀释体积；：供试品的量；对应于稀释体积浓度（1）对照品比较法）对照品比较法 对于固体制剂:P16：制剂的标示量：系指每一支、片或每一个单位制剂中含有主药的重量（或效价）或含量或装量。% =100%CxD WWBWB标示量（ ）：制剂平均重量（装量）；：制剂的标示量；（一）紫外（一）紫外-可见分光光度法可见分光光度法（2）

12、吸收系数法）吸收系数法 引入吸光系数的含量计算方法1%1100XXcmACE1%1c1000% =100%100mA D VEVB标示量（ ）1%1c1000% =100%100mA D WEWB标示量（ ） 溶液 片剂mg转化单位g/mL（2）吸收系数法）吸收系数法 示例：盐酸氯丙嗪注射液的含量测定： 精密量取本品适量（约相当于盐酸氯丙嗪50mg），置200mL量瓶中，加盐酸溶液（9-1000）稀释至刻度，摇匀；精密量取2mL，置100mL量瓶中，用盐酸（91000）稀释至刻度，摇匀；在254nm下测定吸光度，按盐酸氯丙嗪的吸收百分系数计算，即得。 注射液，选溶液公式，如下：1%1cm100

13、0% =100%100A D VEVB标示量（ ）（2）吸收系数法）吸收系数法 D为供试品溶液的稀释体积：共稀释了200mL1002=10000mL1%1cm1000% =100%100A D VEVB标示量（ ） ，是注射液规格（mL/支）：已知 B，注射液标示量（mg/支）：已知 V，供试品取样量：2mL A，吸光度：测量值，已知 ：已知V1%1cmE 固体试剂公式推导如下：（2）吸收系数法）吸收系数法 3.计算分光光度法 多种，具体按每种药物规定的方法进行 如：VA的三点校正法 不宜做含量测定 4.比色法 加入显色剂后，按照对照品比较法测定影响显色因素很多，故需注意平行操作空白溶剂：溶剂

14、+显色剂，同法处理（一）紫外（一）紫外-可见分光光度法可见分光光度法（二）荧光分析法（二）荧光分析法 特点 灵敏度高，可达10-1010-12g/mL 要求低浓度下测定，防止自熄灭作用 干扰因素多，须做空白测定 荧光弱的药物可衍生化后测定，可提高灵敏度和选择性含量测定 原理：当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其荧光强度R与该物质浓度C成正比 方法：对照品比较法 计算：对对对对空空白白对对供供空空白白供供供供CRRRRC （二）荧光分析法（二）荧光分析法 根据混合物中各组分的色谱行为差异，先行分离后再在线或离线对各组分逐一进行分析的方法，是分离分析混合物的最有

15、力手段。 按分离原理：吸附；分配；离子交换；排阻色谱分类 按分离方法：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC 特点：高灵敏度、 高效能、高速度、应用广泛三、色谱分析法三、色谱分析法h hW W1/21/2 0.50.5h h0.6070.607h hW W0tt0tR色谱柱填充剂常用：十八烷基硅烷键合硅胶1. 对仪器一般要求 固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变 其他均可适当改变 色谱图20分钟内记录完毕 2. 系统适用性试验 色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2 分离度：R = 2（tR1 tR2)/(W1 + W2); 应大于1.5 重复性：对照液连续进样5次，

16、峰面积RSD2.0 拖尾因子：T = W0.05h/2d1 应在0.95 1.05（一）（一）HPLC（1）内标法加校正因子测定供试品中主成分含量对照液（对照液（R）：）： AR CR 峰面积 含量内标液（内标液（S）：）： AS CS供试液（供试液（X）：）： AX CXf= AS/CSAR /CRf= AS / CSAx /CxCx=f AxAS / CS3. HPLC测定法测定法（2）外标法测定供试品中主成分含量对照液（对照液（R）：）： AR CR 供试液（供试液（X）：）： AX CXCX CRAX ARCXCR AXAR要求：进样量准确、操作条件稳定3. HPLC测定法测定法3.

17、HPLC测定法测定法 示例一 炔诺酮的含量测定 照高效液相色谱法（附录VD测定） 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（65：35）为流动相，检测波长为244nm。理论塔板数按炔诺酮峰计算不低于1500，炔诺酮峰与内标物质峰的分离度及主成分峰后一杂质峰与主成分峰的分离度均应符合要求。 内标溶液的制备 取黄体酮约25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。3. HPLC测定法测定法 示例一 炔诺酮的含量测定 测定法 取本品约25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液2mL与内标溶液3mL，置10mL量瓶中，

18、加甲醇稀释至刻度，摇匀，取20L注入液相色谱仪，记录色谱仪，记录色谱图；另取炔诺酮对照品适量，精密称定，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。1. 对GC仪器一般要求 载 气：氮气 色谱柱：填充柱或毛细管柱 填充柱：内径24mm，长110m，内装吸附剂 高分子多孔小球或涂渍固定液的载体 毛细管柱：内径0.20.5mm，长10100m，一般 为空心柱，内壁或载体经涂渍或交联 固定液检测器：氢火焰离子化检测器色谱图：30分钟内记录完毕（二）气相色谱法（二）气相色谱法2. 色谱适用性实验：同HPLC3.测定法：同HPLC（二）气相色谱法（二）气相色谱法示例 松节油的含量测定色谱条件与系统适用性试验

19、用聚乙二醇（PEG）-20M为固定相，涂布密度为20%；柱温为90摄氏度。理论塔板数按-蒎烯峰计算应不低于1500.校正因子测定 取正丁醇适量，精密称定，加石油醚（3060 。C ）至刻度，摇匀，吸取1微升注入气相色谱仪，计算校正因子。（二）气相色谱法（二）气相色谱法示例 松节油的含量测定测定法 取本品约35mg，精密称定，置10mL棕色量瓶中，精密加入内标溶液2mL，用石油醚（3060。C ）溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取1微升注入气相色谱仪，测定，即得。本品含-蒎烯（C10H16）不得少于70%。 外标法 标准加入法（二）气相色谱法（二）气相色谱法1.结构特征与分析方法之间的关系 含卤素有机

20、药物 R-X （F，Cl, Br, I ） 卤素与芳环相连 Ar-X 结合牢固， 需有机破坏 卤素与脂肪链相连 R-X 结合较不牢固，不需有机破坏 含金属有机药物 含金属有机药物 R-O-Me，有机酸或酚的金属盐/配位化合物； 结合不牢固，可直接测定 有机金属药物 R-Me ，结合牢固，适当处理后测定 第二节第二节 样品分析的前处理方法样品分析的前处理方法（一）直接测定法适用范围：金属原子不直接于碳原子相连或某些C-M键结合不牢固的有机金属药物。 例如：富马酸亚铁的含量测定 终点：终点： 邻二氮菲邻二氮菲(+Fe3+)溶于热稀矿酸溶于热稀矿酸Fe2+铈量法铈量法Ce4+Fe3+指示剂指示剂:邻

21、二氮菲邻二氮菲 (+Fe2+)红色红色淡蓝色淡蓝色一、不经有机破坏的前处理方法一、不经有机破坏的前处理方法（二）经水解后测定法1. 碱水解后测定法 适用于卤素原子结合不牢固的含卤素有机药物，如卤素与脂肪链相连的卤代烷烃 例如：三氯叔丁醇的含量测定 CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH (CH3)2CO +3NaCl + HCOONa +2H2O NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN + NH4NO3 2. 酸水解后测定法 常用于水难溶的含金属的有机药物，例如：硬脂酸镁的含量测定 Mg(C17H35COO)2 + H2SO4 Mg

22、SO4 + 2C17H35COOH H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O 一、不经有机破坏的前处理方法一、不经有机破坏的前处理方法（三）经还原分解后测定法 适用于Ar-I的药物 例如：碘他拉酸的含量测定COOHIIINHCOCH3CH3CONHCOOHH2NNH2+ 11NaOH + 3Zn+ 3NaI + 2CH3COONa + 3NaZnO2 + 3H2O NaI + AgNO3 AgI + NaNO3 指示剂：曙红钠指示剂：曙红钠终点：黄终点：黄红红一、不经有机破坏的前处理方法一、不经有机破坏的前处理方法 金属原子、卤素等与金属原子、卤素等与C结合牢固者，必须有机破坏结

23、合牢固者，必须有机破坏 湿法破坏湿法破坏 药物分析中常用的有机破坏的方法有药物分析中常用的有机破坏的方法有 H H2 2SOSO4 4-HNO-HNO3 3法法(一)湿法破坏 H H2 2SOSO4 4-HClO-HClO4 4法法 H H2 2SOSO4 4- -硫酸盐法硫酸盐法 H H2 2SOSO4 4-H-H2 2O O2 2,HNO,HNO3 3-KMnO-KMnO4 4法等法等干法破坏干法破坏凯氏定氮法凯氏定氮法二、经有机破坏的分析方法二、经有机破坏的分析方法凯氏定氮法 常量法含氮量2530mg 半微量法含氮量1.02.0mg 应用：含有氨基或酰氨（胺）结构的药物含量。342444

24、42)(SOHN42NHSONHHSONHNaOHSOH 药物药物含含碱滴定碱滴定酸酸吸收液吸收吸收液吸收/凯氏定氮法凯氏定氮法（二）干法破坏 适用于含卤素、S、P等有机药物分析的前处理，也用于某些药物中Se及砷盐的检查 1. 高温炽灼法 用于含卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。 加无水Na2CO3、硝酸镁、氢氧化钙或ZnO以辅助灰化。2.氧瓶燃烧法测定测定吸收吸收无机离子无机离子有机药物有机药物、含含吸收液吸收液、燃烧、燃烧 2OSePSX二、经有机破坏的分析方法二、经有机破坏的分析方法 1） 仪器装置仪器装置 500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬质磨口、硬质 玻璃锥形瓶玻

25、璃锥形瓶 2）称样）称样 固体样；液体样要求固体样；液体样要求 3） 燃烧分解操作法燃烧分解操作法 4） 吸收液的选择吸收液的选择 用于用于X、S、Se等的鉴别、检查、等的鉴别、检查、 含量测定时多数是含量测定时多数是H2O或或H2O-NaOH；少数为少数为 H2O-NaOH-H2O2.氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法应用示例：碘苯酯的测定 目的：证明采用的方法适合于相应检测要求。 起草药品质量标准起草药品质量标准 生产工艺变更生产工艺变更 制剂组分改变制剂组分改变 原分析方法修订原分析方法修订均需对分析方法进行验证均需对分析方法进行验证验证内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性

26、第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证一、准确度 是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示（一）含量测定方法的准确度 1. 原料药：可用已知纯度对照品或供试品进行测定；或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较 加加入入量量测测得得量量回回收收率率100 第三节第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证2. 制剂：考察其他组分和辅料对回收率的影响用含已知量被测物的制剂各组分混合物（包括制剂辅料）进行测定，回收率计算同原料药向制剂中加入已知量的被测物进行测定与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较加入量加入量本底量本底量测得量测得量回收率回收率1

27、00 一、准确度一、准确度（二）具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3, 共9个数据来评价回收率；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98%102%；容量法可达99.7%100.3%。一、准确度一、准确度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定所得结果之间的接近程度。 （一）精密度表示方法 1. 偏差(deviation , d) d = 测得值-平均值=Xi-X 相对偏差（RD）d / X 100最大相对偏差（允许差） 容量分析法0.3，仪器分析法3二、精密度二、精密度 2. 标准偏差（standard deviation, SD或S） S =(Xi X)2/(n-1)1/2

28、3. 相对标准偏差(relative standard deviation, RSD) RSD=标准偏差/平均值100%=S/X 100%二、精密度二、精密度（二）验证内容 1. 重复性 在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度. 2. 中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。 3. 重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。二、精密度二、精密度指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。 鉴别、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。 （一）鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不

29、含被测组分的样品均应呈现负反应。三、专属性三、专属性（二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。 图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。 在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。 在杂质和降解物不能获得的情况下，可用已验证方法或药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。三、专属性三、专属性是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。1.目视法 用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确定能被可靠地检测出的被测物的最低浓度或量，常用于显色鉴别法，TLC 2

30、.信噪比法 当用GC和HPLC法时，一般以S/N2或3时的相应浓度来确定检测限。四、检测限四、检测限 LOD是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。 杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ。常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。五、定量限五、定量限 LOQ是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度或量直接呈正比关系的程度。 回归方程的相关系数（r）越接近1，表明线性越好。六、线性六、线性可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列（至少5份）供试液进行测定，以响应值对浓度作图，建立回归方程，求出r。如UV：制备一个标准系列，

31、浓度点n =5 A=0.3-0.7 建立回归方程C = aA + b r 0.9999是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。 如原料药和制剂含量测定：应为测试浓度的80%120%制剂含量均匀度检查：应为测试浓度的70%- 130%。 溶出度或释放度中的溶出量测定：应为限度的20%。七、范围七、范围 是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。HPLC变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。GC变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。 八、耐用性八、耐用性已有重现性验证，不需验证中间精密度如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充 视具体情况予以验证九、验证内容的选择九、验证内容的选择+各种含量测定方法对效能指标的要求各种含量测定方法对效能指标的要求 1.容量分析法 用原料药精制品（含量9