芦笋提取物对DSS诱导结肠炎模型的作用研究

1、芦笋提取物对DSS诱导结肠炎模型的作用研究朱立华，肖新燕, 许玉刚, 孙秀芬(聊城市第二人民医院，山东临清 252600)摘要 目的:探讨芦笋提取物对DSS诱导结肠炎的干预作用,探讨其作用机制。方法：参照Cooper等的方法建立DSS小鼠结肠炎模型, 32只小鼠(雌雄各半)随机分成A、B、C、D四组，每组小鼠(雌雄各半)自由饮用5%的DSS溶液7天，后换为正常自来水，自第一天起分别用双蒸水、6mg/mL、10 mg/mL、14mg/mL的芦笋提取物每只小鼠灌胃0.5ml/d，至第11天解剖。结果：14mg/mL的芦笋提取物干预组治疗效果最好。结论:芦笋提取物可有效改善DSS结肠炎症状,其作用机

2、制有待进一步研究。关键词: 芦笋 DSS 结肠炎 Balb/c小鼠The research of influence of Asparagus Officinalis extraction to DSS induced colitisZhu Li-hua, Xiao Xin-yan ,Xu Yu-gang ,Sun Xiu-fen(The Second Peoples Hospital of LiaoCheng LinQing LiaoCheng 252600)Abstract:Objective :To study the influence of Asparagus Officinalis

3、 extraction to DSS induced colitis and approach its mechanism of action.Methods: Using the model of DSS induced colitis established in 1990 by Cooper et.al, 32 Balb/c rats (the number of males and females are the same) were divided into 4 groups randomly which named A, B, C and D respectively. The m

4、ice group A was treated with distilled water, meanwhile the mice group B, C, and D were treated with 6mg/mL、10 mg/mL、14mg/mL extraction of Asparagus Officinalis respectively. And then both were given 0.5ml per day until eleven days while 5% DSS treated seven days.Results: among them the amelioration

5、 of group D is the best.Conclusion:The extraction of Asparagus Officinalis can improve the symptom of DSS induced colitis, the mechanism of action should be further research. Keywords: Asparagus Officinalis DSS colitis Balb/c rats芦笋学名石刁柏，又名龙须菜，百合科天门冬属植物，英文名(Asparagus Officinalis)，其含有丰富的黄酮类化合物。 Goyal

6、 等指出在印度草药学有关于芦笋干粉治疗胃肠溃疡的记载，芦笋原汁已被证实对于十二指肠溃疡有明显疗效1。类黄酮类物质广泛存在于各种蔬菜中，其作用机制是通过抑制NF-kB/Rel信号传导途径来减少炎性细胞因子和iNOS的表达，下调炎症反应 2。Hyun Pyo Kim等在植物类黄酮的抗炎症作用及机理中，对各种类黄酮对促炎因子的调节作用做了综述 ，并指出有些类黄酮物质有可能成为新型的抗炎症药物。DSS结肠炎模型是Cooper等1990年建立的国际公认并被广泛应用的实验性UC动物模型3。本实验以芦笋提取物为实验材料，以DSS结肠炎模型为对象，旨在研究本提取物的药用价值，并初步探讨其作用机制。1. 材料与

7、方法BALB/C小鼠32只，雌雄各半。67周龄，体重1824克(山东医科大学动物供应中心提供) 饲养室温度为23士10C；芦笋(Asparagus Officinalis)，市购，长约30cm。1.2 实验仪器与试剂：DSS (分子量3600040000，美国MP公司)；TNF-a 96孔ELISA试剂盒（晶美生物科技有限公司）；IL-6 96孔ELISA试剂盒（晶美生物科技有限公司）；MPO试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；超速离心粉碎机MRK，日本； 旋转蒸发器（上海亚荣玻璃仪器厂 ；KQ-100DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；索氏提取器（天津玻璃仪器厂）。1.3 实验

8、方法 结肠炎模型制备 参照Cooper等的方法建立DSS小鼠结肠炎模型3； 芦笋提取物制备 取芦笋尖部称量洗净后置于60 干燥箱中恒温干燥24h，取出后粉碎；精确称取芦笋干粉10g置于索氏提取器无水乙醇回流提取4小时，再加入新的无水乙醇回流提取4小时，合并提取液；减压浓缩，置于硫酸纸上55干燥，收集干燥后的样品即为芦笋黄酮提取物4。 实验分组 Balb/c小鼠四组每组8只小鼠，雌雄各半，用5DSS连续自由饮用七天，然后换为自来水。将芦笋乙醇提取物用双蒸水配成终浓度为6mg/ml、10mg/ml、14 mg/ml的悬浊液，用前用超声波振荡混匀。从第一天起，每天每只小鼠灌胃剂量为0.5ml,连续灌

9、胃10天。 数据处理数据采用SPSS12.0、Microsoft Office Excel 2003软件对数据进行统计分析。实验第九天，双蒸水组小鼠死亡一只，第十天双蒸水组、6mg/ml、10mg/ml组各死亡一只，整个实验过程中14 mg/ml组无一死亡，生存状态良好，说明芦笋提取物对改善DSS结肠炎模型的症状确实起到一定的作用。2.1 DAI值 从各组DAI值统计可以看出各提取物处理组第八天后DAI值均低于蒸馏水组，并且呈现一定的剂量依赖性。见图1 2.2 结肠长度变化实验结果显示蒸馏水组和三个浓度组相比差异不显著（P0.05），但是可以看出有一定的效果。见图22.3 MPO值测定结果从实

10、验结果可以看出6mg/ml、10 mg/ml、14mg/ml组均有一定的效果，MPO值均低于蒸馏水组，但是统计结果显示只有14mg/ml组与正常对照相比差异显著（P0.05）。图1 各实验组DAI变化情况 图2 各实验组结肠长度变化情况 图3 各实验组MPO值测定结果 图4各实验组IL-6值测定结果 从组织切片来看随着芦笋提取物浓度的增加，小肠绒毛越来越完整，且炎性细胞浸润越来越少。 见图5(AD) 图A双蒸水组10x10 图B 6mg/ml干预组 10x10 图C10mg/ml干预组 10x10 图D14mg/ml干预组10x10图5 图A 双蒸水对照组 粘膜上皮出现较大溃疡，隐窝结构局部消

11、失或变形，大量炎性细胞浸润图B 6mg/mL组 粘膜上皮有溃疡，但面积变小，隐窝腺体丢失约1/3，大量炎性细胞浸润图C 10mg/mL组 粘膜上皮无溃疡，少量隐窝腺体不完整，无明显炎性细胞浸润图D 14mg/mL组 粘膜上皮无溃疡，隐窝腺体完整,无炎性细胞浸润3、讨论本实验采用DSS诱导的结肠炎模型属于免疫性模型，无论在症状还是病理变化上都与人类UC相类似5。DSS是一种硫酸多糖，是ohkausa最先在仓鼠建立成功，随后在豚鼠、SW大鼠、Balb/c小鼠、C57小鼠陆续实验成功。本实验造模过程中Balb/c小鼠饮用5DSS溶液，七天后均出现体重下降、腹泻、隐性或显性便血症状。剖开常关可见水肿，

12、充血；组织切片可见大量炎性细胞浸润，典型的小肠绒毛结构消失，腺体消失等炎症反应；本实验从以下几个方面衡量结肠炎的严重程度: (1)参照Murano M等6建立评估标准，每日监测小鼠的体重、大便性状及便血情况(采用联苯胺法测定)。DAI=体重下降+大便性状+出血情况/3。(2)结肠长度 有资料表明DSS结肠炎模型以结肠的水肿，缩短为特征，结肠长度的缩短在一定程度上可以作为反映炎症严重程度的一个指标7。(3) MPO是主要存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中的一种酶，每个细胞所含的酶量是一定的，其活性反映了中性粒细胞侵润数目和活性，已被公认为评价炎症严重程度的一个指标。(4)HE染色观察腺体破坏及炎性细胞

13、浸润程度。(5) 结肠组织IL-6的含量。从实验结果可以看出,芦笋提取物明显改善了结肠炎的症状,并且呈现出一定的剂量依赖性。在炎性细胞因子中IL-6、IL-1beta、IL-8、TNF-a等均在转录水平上为NF-B/Rel所控制，核因子-B(NF-B)是调控炎症细胞因子基因表达的主要转录调控因子之一，在创伤后的炎症反应中发挥着重要的作用8,9。但是芦笋提取物干预组中IL-6含量并没有下降,而是成剂量依赖性的增加, 说明芦笋类黄酮对结肠炎的改善作用并不是通过抑制NF-B通路，减少炎性细胞因子的释放，这与体外实验结果正好相反；也有可能是在炎性细胞因子增高的同时，抗炎性细胞因子亦增加，或者有另外的作

14、用机制，其具体作用机制有待进一步研究。参考文献1 Goyal RK，Asparagus racemosus-an update. Iindian journal of medical sciences2 Monica Comalada, Desiree Camuesco. In vivo quercitrin anti-inflammatory effect involves release of quercetin, which inhibits inflammation through down- regulation of the NF-kB pathway, Eur J I. 2005

15、, 35:584-592 3 Cooper HS, Murthy SN, Shah RS, Sedergrgran DJ. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colits. Lab Invest, 1993, 69: 238-249 4 崔燕, 卢志强, 景瑞, 赵春荣. 比色法测定黄蜀葵花总黄酮的含量J. 食品与药品. 2005, 7(2A): 49-515 Kimura I, Naghama S, Kawasaki M, etal. Study on the experimental

16、ulcerative colitis model induced by sulfate sodium (DSS) in rat.Nippon Yakurigaku Zasshi. 1996, 108(5): 259-666 Murano M, Maemura K, Hirata I, Toshina K, Nishikawa T, Hamamoto N, Sasaki S, Saitoh O, Katsu K. Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor B (p65)antisense oligonuc

17、leotide on mouse dextran sulphate sodium(DSS)-induced colitis. Clin Exp Immunol , 2000, 120:51-587Egger B, etl. Mice lacking transforming growth factor-alpha have an increased susceptibility to dextran sulfate-induced colitis. Gastroenterology, 1997, 113: 825-8328 Neurath MF, Pettersson S, Meyer zum Buschenfelde KH, Strober W. Local administration of antisense phosphorothioate oligonucleotides to the p65 subunit of NF-kappa B abrogates established experimental colitis in mice.Nat Med. 1996 Sep,