毛细管电泳高频电导法测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量

1、毛细管电泳高频电导法测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量         【摘要】  目的 建立夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的含量测定方法。方法 以布洛芬为内标，采用毛细管区带电泳，高频电导检测；未涂层弹性融硅石英毛细管柱55 cm×75 m ID，有效长度46 cm；1.2 mmol/L三乙胺HCl（pH=10.60）， 环糊精（0.08 mmol/L）为运行缓冲        【摘要】; 目的 建立夏枯草中齐墩果酸和熊

2、果酸的含量测定方法。方法 以布洛芬为内标，采用毛细管区带电泳，高频电导检测；未涂层弹性融硅石英毛细管柱55 cm×75 m ID，有效长度46 cm；1.2 mmol/L三乙胺HCl（pH=10.60）， 环糊精（0.08 mmol/L）为运行缓冲液；分离电压12.5 kV；重力进样10 s（高度20 cm）。结果 齐墩果酸、熊果酸线性范围分别为4.1114.8 g/mL（r=0.9995）和4.3120.4 g/mL（r=0.9996）；平均回收率分别为96.7%和98.2%。结论 该法简便、准确、快速、重现性好，可用于夏枯草药材中齐墩果酸和熊果酸的含量测定。 【关键词】; 毛细管

3、电泳；高频电导检测；夏枯草；齐墩果酸；熊果酸Abstract:Objective To establish a method for determining the content of oleanolic acid and ursolic acid in Prunella vulgaris. Methods; Capillary electrophoresis with high frequency conductivity detector was used to analyze the sample. The separation was performed on a uncoated

4、fused silica capillary of 55 cm×75 m（46 cm effective length）using 1.2 mmol·L-1 triethylamine as washing buffer (containing 0.08 mmol·L-1 cyclodextrin, pH 10.60). The voltage was 12.5 kV and temperature was 25 . The sample was injected by gravity（10 s，20 cm）. Results; The linear ranges

5、 of oleanolic acid and ursolic acid were 4.1114.8; g/mL（r=0.9995）and 4.3120.4; g/mL（r=0.9996）, respectively. The average recoveries of oleanolic acid and ursolic acid were 96.7% and 98.2%, respectively. Conclusion; This method is reliable，rapid and accurate, which could be used for the quantitative

6、analysis of the contents of oleanolic acid and ursolic acid in Prunella vulgaris.Key words:capillary electrophoresis；high frequency conductivity detector；Prunella vulgaris；oleanolic acid；ursolic acid夏枯草为中医临床常用中药，味辛、苦，性寒，具有消火、明目、散结、消肿的作用，用于目赤肿痛、目珠底痛、头痛眩晕、高血压等1。夏枯草中含有多种三萜类成分，以齐墩果酸（oleanolic acid， OA）和

7、熊果酸（ursolic acid，UA）的含量较高，OA和UA属于构造异构体，在分离时具有一定难度。目前有关的含量测定方法有薄层色谱法2、高效液相色谱法3,4、气相色谱法5、毛细管胶束电动色谱法6等检测方法。本文采用毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis,CZE），高频电导（high frequency conductivity detection）检测的方法7，对不同产地夏枯草药材中OA和UA的含量进行测定，为药材质量控制提供了可借鉴的依据。1; 仪器与试药; CES2003毛细管电泳仪，包括高压电源、高频电导检测器及毛细管电泳数据工作站（中山大学化学与

8、化学工程学院研制）。ORION MODEL 828型pH计（美国）。DL360超声波清洗器（宁波石浦海天电子仪器厂），工作频率（4.5±5%） kHz，输出功率240 W。未涂层弹性融硅石英毛细管柱（75 m ID，河北永年锐沣色谱器件有限公司）。; 夏枯草样品（批号1：购自河南；批号2：购自安徽；批号3：购自贵州），均经广东药学院中药鉴定教研室房志坚副教授鉴定为真品。将其粉碎，于60 下干燥4 h，置干燥器内备用。定量方法学考察采用的样品购自河南。; 齐墩果酸对照品（批号：110709200505）、熊果酸对照品（批号：110742200516）、布洛芬对照品（批号：1001792

9、00303）均由中国药品生物制品检定所提供，环糊精（中国医药集团上海化学试剂公司），三乙胺等试剂均为分析纯，水为去离子水（电阻为16.6 M·cm-1）。2; 实验部分2.1; 溶液的制备2.1.1; 内标溶液; 精密称取布洛芬对照品40.6 mg置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为内标贮备液（质量浓度为812 g/mL）。2.1.2; 对照品溶液; 精密称取OA对照品16.4 mg、UA对照品17.2 mg置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（质量浓度分别为328 g/mL和344 g/mL）。2.1.3; 供试品溶液; 取本品粉末约

10、1 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇80 mL，加热回流2 h，放冷，提取液转移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.45 m滤膜过滤，作为供试品溶液。2.2; 电泳条件; 未涂层弹性融硅石英毛细管柱55 cm×75 m ID，有效长度46 cm；以1.2 mmol/L三乙胺HCl（pH=10.60），环糊精（0.08 mmol/L ）为运行缓冲液；分离电压12.5 kV；重力进样10 s（高度20 cm）；温度25 ，湿度小于45%。毛细管柱在使用前依次用去离子水、0.1 mol·L-1的NaOH溶液、去离子水、缓冲液各冲洗5 min；检测电极和缓冲液容器用

11、超声波清洗10 min。进样5次之后需按照上述步骤清洗毛细管。对照品、样品色谱图见图1。2.3; 方法学考察2.3.1; 标准曲线制备; 分别吸取一定量的对照品贮备液、内标溶液，加甲醇稀释成含齐墩果酸质量浓度为4.1、8.2、16.4、32.8、49.2、82.0、114.8 g/mL，熊果酸质量浓度为4.3、8.6、17.2、34.4、51.6、86.0、120.4 g/mL与内标溶液质量浓度均为40.6 g/mL的系列溶液。依次重力进样10 s，每个浓度测定3次以上。以对照品与内标峰面积的比值为纵坐标（Y），对照品溶液的质量浓度（）为横坐标进行线性回归，分别得回归方程YOA =0.012-

12、0.032 1（r=0.999 5）；YUA=0.011 9-0.030 9（r=0.999 6）。表明OA质量浓度在4.1114.8 g/mL、UA质量浓度在4.3120.4 g/mL范围内与峰面积线性关系良好。1.齐墩果酸； 2.熊果酸； 3.布洛芬； 4.水图1; 对照品（A）和样品（B）的毛细管电泳色谱图（略）Fig.1; HPCE chromatograms of the controls (A) and samples (B）2.3.2; 精密度试验; 取质量浓度分别为82.0、86.0 g/mL的OA与UA对照品溶液，重力进样10 s，连续测定5次，记录峰面积并计算RSD。结果OA的RSD=2.48%、UA的RSD=3.73%，表明仪器精密度良好。2.3.3; 稳定性试验; 取供试品溶液（批号1）在0、2、4、8、24 h，分别重力进样10 s，记录峰面积。结果OA的RSD=4.54%、UA的RSD=1.21%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。2.3.4; 重复性试验; 取同一批号（批号1）样品6份，按“2.1.3”项下方法提取、测定。结果OA的平均含量为1.01 mg·g-1，RSD=4.10%（n=6