第三章细胞生物学研究方法

1、l本章主要介绍细胞形态结构的观察方法、细胞本章主要介绍细胞形态结构的观察方法、细胞组分的分析方法、以及细胞培养和细胞工程方组分的分析方法、以及细胞培养和细胞工程方面的技术与研究。面的技术与研究。l本章主要考查各类方法技术的原理及用途本章主要考查各类方法技术的原理及用途,考查形式考查形式多样。多样。l光学显微镜技术主要考查分辨率及其影响因素光学显微镜技术主要考查分辨率及其影响因素,各种各种特殊显微镜的基本特点及应用范围特殊显微镜的基本特点及应用范围.l电子显微镜技术则在设计原理及类型、样品制备技电子显微镜技术则在设计原理及类型、样品制备技术（超薄切片、负染色、冰冻蚀刻、免疫电镜技术）术（超薄切片

2、、负染色、冰冻蚀刻、免疫电镜技术）的原理及应用方面以简答题形式为主。的原理及应用方面以简答题形式为主。l细胞内各种化学成分的定性细胞内各种化学成分的定性、定位和定定位和定量分析技术、细胞化学与组织化学法、量分析技术、细胞化学与组织化学法、免疫细胞化学法、各种分光光度术、放免疫细胞化学法、各种分光光度术、放射自显影和分子杂交技术等，考查的形射自显影和分子杂交技术等，考查的形式多以实验设计为主进行考查。式多以实验设计为主进行考查。l第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法l第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法l第三节第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、

3、细胞工程与显微操作技术l第四节第四节 用于细胞生物学研究的模式生物用于细胞生物学研究的模式生物l 本节主要本节主要内容：内容：l一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术l二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术l三、扫描隧道显微镜三、扫描隧道显微镜形态观察形态观察一、光学显微镜技术（一、光学显微镜技术（light microscopy) (一一)普通复式光学显微镜技术普通复式光学显微镜技术 (二二)相差显微镜相差显微镜（phase-contrast microscope） (二二)微分干涉显微镜微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope

4、, DIC） (二二)录像增差显微镜技术录像增差显微镜技术（video-enhance microscopyvideo-enhance microscopy）(三三)荧光显微镜技术荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）(四四)激光共焦扫描显微镜技术激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy）(五五)荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术(36) (六六)荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术l1. 普通复式光学显微镜组成普通复式光学显微镜组成l2. 2. 普通光镜的成像原理普通光镜的成像原理l3. 3. 普通光镜的应用优缺点普通光镜的应用优

5、缺点目镜物镜集光器载物台光源第一节第一节 细胞形态结构细胞形态结构的观察方法的观察方法光学放大系统光学放大系统目镜目镜物镜物镜照明系统照明系统光源光源折光镜折光镜聚光镜聚光镜机械和机械和支架系统支架系统镜臂镜臂底座底座载物台载物台其他其他(镜筒、物镜转换器、调焦装置镜筒、物镜转换器、调焦装置)图像图像样品样品光线光线聚光器聚光器物镜物镜光学显微镜的光路图光学显微镜的光路图D: 分辨率分辨率(指显微镜或人眼在指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能区分开的明视距离处，能区分开两个质点之间的距离两个质点之间的距离)； ：光源波长：光源波长 ：物镜镜口角：物镜镜口角(标本在光轴的一点对物镜镜口的张角

6、标本在光轴的一点对物镜镜口的张角)N: 介质的折射率介质的折射率计算可知，介质为空气时计算可知，介质为空气时 N=1, D 0.3 m; 介质为香柏油时介质为香柏油时 N=1.5, D 0.2 m普通光镜的最大分辨率为普通光镜的最大分辨率为0.2 m=200nml判断题：判断题：在使用光学显微镜时，如果物镜不变，用在使用光学显微镜时，如果物镜不变，用10倍的目倍的目镜时的分辨率比用镜时的分辨率比用5倍的目镜高倍的目镜高1倍。倍。l（ ）l比较放大率和分辨率的含义。比较放大率和分辨率的含义。l总结总结:物镜已经分辨清楚地细微结构，假如没有经过目镜的物镜已经分辨清楚地细微结构，假如没有经过目镜的再

7、放大，达不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚。但物再放大，达不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚。但物镜所不能分辨的细微结构，虽然经过高倍目镜的再放大，也镜所不能分辨的细微结构，虽然经过高倍目镜的再放大，也还是看不清楚。所以目镜只能起放大作用，不会提高显微镜还是看不清楚。所以目镜只能起放大作用，不会提高显微镜的分辨率。的分辨率。l优点优点：操作简便、样品制备简便、成本低：操作简便、样品制备简便、成本低l缺点缺点：分辨率较低，图像反差小：分辨率较低，图像反差小l应用应用：应用领域极为广泛，主要用于观察：应用领域极为广泛，主要用于观察被检物的细微结构。被检物的细微结构。返回返回l1.原理原理:光线

8、通过样品时，产生光线通过样品时，产生直射光直射光和和衍射光衍射光，相差板相差板使两种光的使两种光的光程差光程差(相位差相位差)肉眼不可识别肉眼不可识别增加，通过透镜后，二者互相增加，通过透镜后，二者互相干涉干涉，所形成的，所形成的合合成光成光与背景光与背景光直射光直射光的的振幅差振幅差表现为肉眼可见表现为肉眼可见的明暗反差。总之，的明暗反差。总之，相差显微镜把光线通过样品相差显微镜把光线通过样品后形成的相位差后形成的相位差(光程差光程差)转化为振幅差转化为振幅差(明暗图像明暗图像)l广泛应用于医学、生物学尤其细胞生物学。广泛应用于医学、生物学尤其细胞生物学。l优点：观察优点：观察活体细胞活体细

9、胞，并且，并且不需不需染色染色返回返回l1.原理原理 平面偏振光平面偏振光经经棱镜棱镜折射后分成折射后分成两束，两束，在在不同不同时间时间经过样品相邻部位后，再经经过样品相邻部位后，再经另外一个棱另外一个棱镜镜使两束光使两束光汇合汇合，从而，从而把样品厚度上的微小把样品厚度上的微小差别转化为明暗区别差别转化为明暗区别。l观察活细胞中较大的细胞器。观察活细胞中较大的细胞器。lDICDIC显显微镜使细胞的细微结构微镜使细胞的细微结构立体感特别强立体感特别强，适合于显微操作。目前像适合于显微操作。目前像基因注入、核移植基因注入、核移植等等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进生物工程的显微操作常在这种

10、显微镜下进行。行。DIC显微镜显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜相差显微镜相差显微镜普通显微镜普通显微镜返回返回 计算机辅助的计算机辅助的DIC显微镜可在显微镜可在高分辨高分辨率率下研究下研究活细胞活细胞中的颗粒及中的颗粒及细胞器细胞器的运动。的运动。l中的颗粒及中的颗粒及细胞器细胞器的运动的运动返回返回l1.技术原理技术原理l2.结构性能结构性能l3.应用应用l强光源发出紫外光和蓝紫光，强光源发出紫外光和蓝紫光， 经过滤光系经过滤光系统，统， 照射到样品，照射到样品， 激发样品中的荧光物激发样品中的荧光物质发出可见荧光，质发出可见荧光， 通过物镜和目镜放大通过物镜和目镜放大成像，成像， 观察和摄

11、像观察和摄像1激发滤光片激发滤光片2分色镜分色镜二相色镜二相色镜3阻断滤光片阻断滤光片l(1)荧光光源荧光光源-高压汞灯、氙灯高压汞灯、氙灯l(2)滤色系统滤色系统 a.激发滤光片激发滤光片-选择激发光的波长选择激发光的波长 b.阻断滤光片阻断滤光片-吸收或阻挡激发光进入目镜，吸收或阻挡激发光进入目镜，防止成像干扰和保护眼睛防止成像干扰和保护眼睛l(3)光路系统光路系统 由光源、滤色系统、集光镜、反光镜、物镜和由光源、滤色系统、集光镜、反光镜、物镜和目镜等组成目镜等组成l目前对目前对特异蛋白质等生物大分子定性定位研究的最有力工具特异蛋白质等生物大分子定性定位研究的最有力工具。l荧光显微镜技术包

12、括荧光显微镜技术包括:l荧光素直接标记技术荧光素直接标记技术和和间接免疫荧光标记间接免疫荧光标记技术技术 优点：优点：图像清晰，灵敏度高，细胞内物质可做特异性观察与图像清晰，灵敏度高，细胞内物质可做特异性观察与分析分析分裂细胞的分裂细胞的免疫荧光图免疫荧光图像像不同荧光染料不同荧光染料标记标记抗抗 体体抗原抗原(细胞的蛋白质成分细胞的蛋白质成分)特异性结合特异性结合返回返回l1.原理原理：激光源激光源经过经过双色镜双色镜反射，经反射，经物镜物镜后汇聚到后汇聚到样样品品(预先经免疫荧光标记预先经免疫荧光标记)的某一的某一焦点焦点，从焦点发出的，从焦点发出的荧光经过透镜汇聚成像并被荧光经过透镜汇聚

13、成像并被检测器检测器检出检出,而非焦点区而非焦点区的荧光不能汇聚成像。的荧光不能汇聚成像。 逐点、逐行、逐面逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点的聚焦点，也是瞬时成像的物点。 l2.应用应用：观察亚细胞结构如内质网膜系统和：观察亚细胞结构如内质网膜系统和细胞骨架系统等细胞内的复杂网络。细胞骨架系统等细胞内的复杂网络。 3.3.优点优点：A.A.通过共聚焦可进行通过共聚焦可进行“光学切片光学切片”，观察较厚样品内部结构，观察较厚样品内部结构，排除焦平面以

14、外光的干排除焦平面以外光的干扰，增强扰，增强 图像反差和提高分辨率图像反差和提高分辨率(1.41.7)(1.41.7)，获得样品三维结构；获得样品三维结构； B. B.对固相、液相物体均可进行观察对固相、液相物体均可进行观察牛肺动脉的内牛肺动脉的内皮细胞皮细胞Mitose - Tubulin (FITC), DNA (PJ)返回返回l1应用应用 该技术是检测活体中生物大分子纳该技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。接的相互作用。l2

15、原理原理 430490430530l1原理：见原理：见p56l2 应用应用 ：lFARP可以用于解决活细胞内包括蛋白质定可以用于解决活细胞内包括蛋白质定位、动力学以及其他成分相互作用等问题。位、动力学以及其他成分相互作用等问题。 这种显微镜使这种显微镜使照明光线不照明光线不能直接进入物镜能直接进入物镜，只允许被，只允许被标本标本反射和衍射的光线进入反射和衍射的光线进入物镜物镜。倒置显微镜倒置显微镜：物镜和聚光镜的物镜和聚光镜的工作距离较长工作距离较长，可以直接研，可以直接研究观察备检物结构，观察培究观察备检物结构，观察培养物细胞形态特征，细胞分养物细胞形态特征，细胞分裂分化等。裂分化等。l（一

16、）电子显微镜的电子显微镜的基本知识基本知识l（二）主要电镜制样技术主要电镜制样技术上一页上一页1.电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较2.电镜与光镜光路图比较电镜与光镜光路图比较3.电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造上一页上一页l分辨率高，成像清晰；透射电镜观察细分辨率高，成像清晰；透射电镜观察细胞内部亚显微结构，扫描电镜观察下表胞内部亚显微结构，扫描电镜观察下表面结构生成三维立体图像。面结构生成三维立体图像。1. 超薄切片技术超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备用于电镜观察的样本制备示意图示意图 2.负染色技术负染色技术（Negative staining）与）与金属投影金属投影 染色背景

17、，衬托出样品的精细结构染色背景，衬托出样品的精细结构3.冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。粒和膜表面结构。 快速冷冻快速冷冻深度蚀刻技术深度蚀刻技术（quick freeze deep etchingquick freeze deep etching）4.电镜三维重构技术电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。具有重要应用前

18、景的一门新技术。电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与X-X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学合，是当前结构生物学（Structural BiologyStructural Biology） 主要研究生主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。 通常以通常以锇酸锇酸和和戊二醛戊二醛固定样品，以固定样品，以环氧树环氧树脂脂包埋，以包埋，以热膨胀或热膨胀或螺旋推进螺旋推进的方式推进的方式推进样品切片，样品切片，切片厚度切片厚度2050nm，切片采用，切片采用重金属盐染色重金属盐染色

19、，以增，以增大反差。大反差。返回返回负染就是用负染就是用重金属盐重金属盐（如磷钨（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在酸、醋酸双氧铀）对铺展在载载网上网上的样品进行染色；吸去染的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品料，样品干燥后，样品凹陷处凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出铺了一薄层重金属盐，而凸出的地方则没有染料沉积的地方则没有染料沉积，从而，从而出现负染效果出现负染效果返回返回l亦称冰冻断裂（亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。步骤如下：）。步骤如下：l(1)(1)标本置于标本置于-100C的干冰或的干冰或-196C的液氮中，进的液氮中，进行行冰冻冰冻。l(2)(2)然后用冷刀骤然

20、将然后用冷刀骤然将标本断开，标本断开，l(3)(3)升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为结构，称为蚀刻（蚀刻（etching）。）。l(4)(4)蚀刻后，向断面以蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，度角喷涂一层蒸汽铂，再以再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。度角喷涂一层碳，加强反差和强度。- -(-(复型复型) )l(5)(5)然后用次氯酸钠溶液然后用次氯酸钠溶液消化样品消化样品，把碳和铂，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为的膜剥下来，此膜即为复膜复膜（replica）。复）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到膜显示出了标本蚀

21、刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。返回返回返回返回返回返回i 电子电子“探针探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。探测器收集二次电子成象。 它是将标本表面上发射出的它是将标本表面上发射出的次级电子次级电子(二次电子二次电子) )，被探测器被探测器(带样电荷的栅极带样电荷的栅极)收集后，即向收集后，即向电子显象电子显象管管发送信号，在荧光屏上显示出发送信号，在荧光屏上显示出与电子束同步的扫与电子束同步的扫描图像描图像。图像为。图像为立体形象立体形象，反映了标本表面的真实反映了

22、标本表面的真实结构。结构。第第一一节节 形形态态观观察察技技术术Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：包括：STMSTM、AFMAFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等、磁力显微镜、摩擦力显微镜等原理原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离：扫描探针与样品接触或达到很近距离(100nm)(100nm)时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来

23、，从而反映出样摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 装置：装置：扫描的压电陶瓷扫描的压电陶瓷，逼近装置逼近装置，电子学反电子学反馈控制系统馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。和数据采集、处理、显示系统。特点：（特点：（1 1）可对晶体或非晶体成像，无需复）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为0.10.10.2nm0.2nm，纵分辨率可达，纵分辨率可达0.01nm0.01nm）；）；（2 2）可实时得到样品表面）可实时得到样品表面三维图象三维图象，可测量厚，可测

24、量厚度信息；度信息；（3 3）可在）可在真空、大气、液体真空、大气、液体等多种条件下工作；等多种条件下工作；非破坏性非破坏性测量。测量。（4 4）可）可连续连续成像，进行成像，进行动态动态观察。观察。用途：纳米生物学研究领域中的重要工用途：纳米生物学研究领域中的重要工具具, ,在在原子水平原子水平上揭示样本表面的结构上揭示样本表面的结构, ,直接观察生物大分子，如直接观察生物大分子，如DNA、RNA和和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。扫描隧道电子显微镜下金扫描隧道电子显微镜下金原子的晶格

25、排列图像原子的晶格排列图像第一节第一节 细胞形态结构细胞形态结构的观察方法的观察方法l问答题：问答题：根据光镜与电镜的特点，观察下列结构根据光镜与电镜的特点，观察下列结构采用哪种显微镜好？如果用光镜（暗视野、相差、采用哪种显微镜好？如果用光镜（暗视野、相差、免疫荧光显微镜）哪种最有效？为什么？免疫荧光显微镜）哪种最有效？为什么？lA.植物细胞中叶绿体的运动植物细胞中叶绿体的运动lB.病毒颗粒病毒颗粒lC.细菌的运动细菌的运动lD.某组织中含一种特异蛋白质的细胞某组织中含一种特异蛋白质的细胞l答：A观察植物细胞中叶绿体的运动，应采用光镜，观察植物细胞中叶绿体的运动，应采用光镜，因为电镜要杀死细胞

26、。光镜中采用相差显微镜最因为电镜要杀死细胞。光镜中采用相差显微镜最好，因为该显微镜可观察不经染色的活细胞及其好，因为该显微镜可观察不经染色的活细胞及其动态变化，以叶绿体的大小可以很容易分辨清楚，动态变化，以叶绿体的大小可以很容易分辨清楚，有较好反差。用荧光显微镜也可，因为叶绿体可有较好反差。用荧光显微镜也可，因为叶绿体可自发红色荧光。自发红色荧光。lB观察病毒颗粒，应采用电镜，因为太小，光镜无观察病毒颗粒，应采用电镜，因为太小，光镜无法分辨。法分辨。 lC.观察细菌的运动，应采用光镜。观察细菌的运动，应采用光镜。暗视野显微镜暗视野显微镜，因，因为其可以观察活的未染色的细胞，尤其适合观察整体为其

27、可以观察活的未染色的细胞，尤其适合观察整体细胞及其运动，反差好。细胞及其运动，反差好。相差显微镜相差显微镜也可。也可。lD.观察某组织中含一种特异蛋白的细胞，应采用光镜，观察某组织中含一种特异蛋白的细胞，应采用光镜，因为对于电镜来说组织太大。因为对于电镜来说组织太大。免疫荧光显微镜免疫荧光显微镜，它是，它是大分子定位中唯一的光镜方法，可以用带有荧光标记大分子定位中唯一的光镜方法，可以用带有荧光标记的特异蛋白的抗体在细胞中对特异蛋白进行定位，再的特异蛋白的抗体在细胞中对特异蛋白进行定位，再进行荧光观察。进行荧光观察。l未染色活体细胞未染色活体细胞 扫描电镜显微技术扫描电镜显微技术l病毒颗粒病毒颗

28、粒 超薄切片显微技术超薄切片显微技术l高尔基体结构高尔基体结构 负染色电镜技术负染色电镜技术l细菌的移动细菌的移动 冷冻蚀刻电镜技术冷冻蚀刻电镜技术l细胞中某蛋白的分布细胞中某蛋白的分布 电镜三维重构技术电镜三维重构技术lGFP融合蛋白在花粉管生长融合蛋白在花粉管生长 暗视野显微技术暗视野显微技术l过程中的变化过程中的变化 l细胞膜中的蛋白颗粒细胞膜中的蛋白颗粒 普通复式光镜技术普通复式光镜技术l果蝇口器的立体结构果蝇口器的立体结构 相差显微技术相差显微技术l蛋白质二维晶体结构蛋白质二维晶体结构 荧光显微技术荧光显微技术l考染后的植物细胞骨架考染后的植物细胞骨架 confocal 显微技术显微

29、技术本节主要内容：本节主要内容：l一、一、 离心分离技术离心分离技术l二、二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂质等的显示方法细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂质等的显示方法l三、三、特异蛋白抗原的定位与定性特异蛋白抗原的定位与定性l四、四、细胞内特异核酸序列的定位与定性细胞内特异核酸序列的定位与定性l五、五、放射自显影技术放射自显影技术l六、六、定量细胞化学分析技术定量细胞化学分析技术nextnextnextnextnextnext用途：用于分离细胞器与生物大分子及其复合物用途：用于分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心差速离心：即利用不同的离心速度所产生的不同离：即利用不同的离心速度所产生的不

30、同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。密度梯度离心密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离纯化。：精细组分或生物大分子的分离纯化。l在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。于分离不同大小的细胞和细胞器。l在差速离心中细胞器沉降的在差速离心中细胞器沉降的顺序依次顺序依次为：为：核、线核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核蛋白体体、最后为核蛋白体。g=1.11g=1.1110105 5R(rpm)R(rpm)2 2 R

31、R为中轴到离心管远端半径为中轴到离心管远端半径 rpm rpm每分钟转速每分钟转速l差速离心差速离心用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器离细胞器。 低速离心（低速离心（1000g，10min) 中速离心中速离心 （20000g，20min 高速离心高速离心 （80000g，1h 超高速离心超高速离心 （150000g，3h细胞匀浆细胞匀浆细胞核（完整）细胞核（完整）细胞骨架细胞骨架大细胞器：大细胞器：线粒体、溶酶体、过氧化物体线粒体、溶酶体、过氧化物体小细胞器：微粒体、小泡小细胞器：微粒体、小泡核糖体、核糖体、病毒、病毒、大分子大分子复合物复合物 upl

32、用一定的介质在离心管内形成用一定的介质在离心管内形成一连续或一连续或不连续的密度梯度，不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀将细胞混悬液或匀浆置于浆置于介质的顶部介质的顶部，通过，通过重力或离心力重力或离心力场的作用场的作用使细胞分层、分离。使细胞分层、分离。l密度梯度离心常用的介质为密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。糖和多聚蔗糖。 l速度沉降速度沉降（velocity sedimentation）主）主要用于分离要用于分离密度相近而大小不等密度相近而大小不等的细胞的细胞或细胞器。或细胞器。l等密度沉降等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离适

33、用于分离密度不等密度不等的颗粒。的颗粒。离心离心 样品样品蔗糖的稳定梯度蔗糖的稳定梯度慢速沉降成分慢速沉降成分快速沉降成分快速沉降成分分画分画样品样品蔗糖的不连蔗糖的不连续梯度续梯度低浮力密度低浮力密度成分成分高浮力密度高浮力密度成分成分原理原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。判断某种物质在细胞中的分布和含量。 例如例如: Feulgen Staining-DNA在细胞内的定位在细胞内的定位.

34、下一页下一页l孚尔根反应（显示孚尔根反应（显示核酸）核酸）-紫红色紫红色lPAS反应反应(过碘酸过碘酸-希夫试剂反应，显示希夫试剂反应，显示多糖和糖蛋多糖和糖蛋白白)-紫红色紫红色l四氧化锇染色（四氧化锇染色（不饱和脂肪酸）不饱和脂肪酸）-黑色黑色l苏丹苏丹（脂肪酸）脂肪酸）-深红色深红色l苏丹黑（苏丹黑（脂肪酸）脂肪酸）-黑色黑色l米伦反应（米伦反应（蛋白质）蛋白质）-红色红色l格莫瑞反应（格莫瑞反应（碱性磷酸酶）碱性磷酸酶）-灰或者黑色灰或者黑色up最典型的组织化学显示法是最典型的组织化学显示法是Feulgen反应反应显示法显示法(Feulgen reaction)。此法由。此法由Feul

35、gen和和Rossenbeck (1924)发明，对发明，对DNA的反应具有高度专一性。的反应具有高度专一性。其原理是其原理是: : 标本经稀盐酸水解后，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红与醛基反应，形成含有醌基的试剂中的无色品红与醛基反应，形成含有醌基的化合物，醌基为发色团，呈现出化合物，醌基为发色团，呈现出紫红色紫红色。up 根据免疫学原理，利用根据免疫学原理，利用抗体抗体同特定同特定抗原抗原结合，对抗原进行专一定位测定的技术。结合，对抗原进行专一定位测定的技术。如果

36、将抗体结合上如果将抗体结合上标记物，标记物，再与组织中再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。显示出该抗原存在于组织中的部位。常用的标记物有常用的标记物有荧光素荧光素和和酶酶：标 记 荧 光 素 的 称 为标 记 荧 光 素 的 称 为 免 疫 荧 光 技 术免 疫 荧 光 技 术( (immunofluorescent technique)immunofluorescent technique)，常用的荧光素，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素有异硫氰酸荧光素( (FITC)FITC)、罗丹明、罗丹明( (rhodamine)r

37、hodamine)等。等。标记酶的称为标记酶的称为酶标免疫法酶标免疫法( (enzyme-labelled enzyme-labelled antibody method)antibody method)，常用的酶有常用的酶有辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶( (horseradish peroxidase)horseradish peroxidase)等，酶与底物发生反应等，酶与底物发生反应后形成后形成不透明的沉积物不透明的沉积物或或有色物有色物，从而显示出抗原从而显示出抗原的存在部位的存在部位。l（一）（一）免疫荧光技术免疫荧光技术：快速、灵敏、有：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限特异性，

38、但其分辨率有限 （图图）l 免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法在细胞内分布的方法. .此技术是根据抗原抗此技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体或组织内的相应抗原（或抗体) )。l在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素

39、，利用荧光显微镜观察标上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的的荧光（黄绿色或桔红色荧光（黄绿色或桔红色），可以看见），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。术测定含量。 免疫电镜技术免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。方法学。可以分为下列技术：可以分为下列技术

40、：l免疫铁蛋白技术免疫铁蛋白技术l免疫酶标技术免疫酶标技术l免疫胶体金技术免疫胶体金技术 应用：应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等等l铁蛋白铁蛋白是一种含铁约占是一种含铁约占23%的蛋白质。抗体与铁蛋的蛋白质。抗体与铁蛋白结合为双分子复合物，保留抗体的免疫活性，同白结合为双分子复合物，保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有致密的铁离子核心，具有很高的时因为铁蛋白含有致密的铁离子核心，具有很高的电子密度，便于电镜观察。电子密度，便于电镜观察

41、。l商品铁蛋白商品铁蛋白主要是从主要是从马脾脏马脾脏中提取的。中提取的。l在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性( () )，否则，否则判为阴性判为阴性( () )。l是以是以胶体金胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。疫标记技术。l氯金酸（氯金酸（HAuClHAuCl4 4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用酸等作用下

42、，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，而且不影响蛋白质的生物特性。而且不影响蛋白质的生物特性。l在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。l黑褐黑褐色颗粒色颗粒upl研究表皮生长因子受体在细胞分布的部位可用（研究表皮生长因子受体在细胞分布的部位可用（ ）lA.原位杂交技术原位杂交技术 B.显微操作技术显微操作技术 lC.免疫电镜技术免疫

43、电镜技术 D.细胞融合技术细胞融合技术 光镜水平的原位杂交技术光镜水平的原位杂交技术 （用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染（用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法称为色体上或在细胞中的位置的方法称为原位杂交原位杂交. . 放射性同位放射性同位素标记的探针与样品中的核酸杂交后，用显微放射自显影的素标记的探针与样品中的核酸杂交后，用显微放射自显影的方法显示杂交物的存在部位或荧光素标记的核酸探针方法显示杂交物的存在部位或荧光素标记的核酸探针, ,与样与样品中的待测核酸杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所品中的待测核酸杂交后，其侧链可被带有荧光

44、标记的抗体所识别，在荧光显微镜下直接显示与探针杂交的核酸的位置识别，在荧光显微镜下直接显示与探针杂交的核酸的位置 ）电镜水平的电镜水平的原位杂交技术原位杂交技术 （生物素标记的探针生物素标记的探针与与抗生物素抗体相连的胶体金标记抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）结合）下一页下一页l例题：假设已有质粒中含有例题：假设已有质粒中含有rRNA基因克隆的大肠杆菌菌株，基因克隆的大肠杆菌菌株，如何显示如何显示rRNA基因存在于小鼠的哪些染色体上？基因存在于小鼠的哪些染色体上？lDNA探针的制备：从菌株中分离探针的制备：从菌株中分离rDNA，并用放射性同位素，并用放射性同位素标记；标记；l小鼠骨髓染色体制

45、备：用秋水仙素处理小鼠，分离骨髓细胞、小鼠骨髓染色体制备：用秋水仙素处理小鼠，分离骨髓细胞、固定、制片；固定、制片；l原位杂交：将染色体制片中的原位杂交：将染色体制片中的DNA进行变性处理，并与进行变性处理，并与rDNA探针杂交；探针杂交；l放射自显影放射自显影l显微镜观察：根据银粒的出现部位确定显微镜观察：根据银粒的出现部位确定rRNA基因存在于小基因存在于小鼠的哪些染色体上。鼠的哪些染色体上。l已知动物细胞中含有已知动物细胞中含有actin基因，如何证明蚕豆细胞基因基因，如何证明蚕豆细胞基因组是否存在组是否存在actin基因？若存在，如何证明该基因在染色基因？若存在，如何证明该基因在染色体

46、上的位置？体上的位置？l答：证明：答：证明：1）DNA探针制备：动物细胞中分离探针制备：动物细胞中分离actin基因，基因，用放射性同位素进行标记作为探针；用放射性同位素进行标记作为探针；l2）Southern杂交：从蚕豆细胞匀浆中分离核酸，用琼脂杂交：从蚕豆细胞匀浆中分离核酸，用琼脂糖凝胶分离糖凝胶分离DNA片段，再通过印迹转膜到片段，再通过印迹转膜到NC上，将膜上上，将膜上的的DNA进行变性处理，加入放射性进行变性处理，加入放射性DNA探针进行杂交；探针进行杂交；l3）放射自显影分析：在膜上涂布乳胶、曝光、显影、定）放射自显影分析：在膜上涂布乳胶、曝光、显影、定影，通过银粒的出现与否确定蚕

47、豆基因组中是否存在影，通过银粒的出现与否确定蚕豆基因组中是否存在actin基因。基因。l若存在再采用原位杂交技术若存在再采用原位杂交技术返回返回lSouthern bloting (DNA印迹法）：印迹法）：用凝胶电泳用凝胶电泳把把DNA限制性片段的混合物分散开以后，通过限制性片段的混合物分散开以后，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，做成一个扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，做成一个凝胶复制品。在滤膜上加放射性凝胶复制品。在滤膜上加放射性DNA探针与之探针与之杂交，通过放射自显影就可确定与杂交，通过放射自显影就可确定与DNA探针互探针互补的特异核苷酸序列。补的特异核苷酸序列。l又称又称Nort

48、hern杂交，是检测或分析杂交，是检测或分析RNA样品的一种样品的一种方法。方法。 RNA印迹的过程与印迹的过程与Southern 印迹相似，只是印迹相似，只是此时转移的核酸是此时转移的核酸是RNA，而不是，而不是DNA。单链。单链RNA按按其大小在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳上分开，然其大小在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳上分开，然后通过毛细作用转移到硝基纤维素膜上，经烘干，后通过毛细作用转移到硝基纤维素膜上，经烘干，被牢固吸附的被牢固吸附的RNA与放射性标记的单链核酸（通常与放射性标记的单链核酸（通常是单链是单链DNA）探针杂交，接着可用放射自显术来检）探针杂交，接着可用放射自显术来检测杂交情况

49、。测杂交情况。upl是一种类似是一种类似Southern 印迹的技术，用于印迹的技术，用于检测混合物中的特异蛋白质。样品经过检测混合物中的特异蛋白质。样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分散开以后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分散开以后，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，然扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，然后用与标记物标记的抗体与之反应，在后用与标记物标记的抗体与之反应，在特异抗原抗体反应的条带处出现标记物，特异抗原抗体反应的条带处出现标记物，从而从而检测出某一特异蛋白质的存在。检测出某一特异蛋白质的存在。l用凝胶进行抗原抗体反应，再进行印迹用凝胶进行抗原抗体反应，再进行印迹的方法。的方法。l用胰岛素蛋白的

50、基因作探针，与胰岛细胞、成红细胞和输卵管细胞总DNA的限制性内切酶片段及三种细胞的总RNA分别进行分子杂交，试分析杂交结果及原因。（华中师大）原理及应用：原理及应用：利用放射性同位素的电离辐射对乳胶利用放射性同位素的电离辐射对乳胶( (含溴化银或卤化银含溴化银或卤化银) )的感光作的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。步骤：步骤：标记标记制片制片涂胶涂胶曝光曝光显影显影 定影定影观察观察l一3H-标记体外培养细胞标记体外培养细胞l1.培养细胞

51、培养细胞l2.放射性同位素掺入细胞放射性同位素掺入细胞DNAl3.洗涤洗涤(Hank液洗液洗10min )l4.固定固定(卡诺固定液固定卡诺固定液固定1020min)l5.洗涤洗涤(90%乙醇乙醇-70%乙醇各洗乙醇各洗5min),盖盖玻片干燥玻片干燥.l6.贴片贴片l7.制备保护膜制备保护膜(1%的明胶液的明胶液)覆盖在标本覆盖在标本与载玻片上与载玻片上,然后干燥然后干燥.l二制备乳胶膜二制备乳胶膜l1. 蒸馏水蒸馏水2ml+核乳胶核乳胶2ml.(暗室进行暗室进行)40水浴水浴中保温中保温15min乳胶溶化乳胶溶化.l2.用浸蘸法或滴胶法涂布乳胶用浸蘸法或滴胶法涂布乳胶.l三三曝光曝光(一周

52、时间一周时间,将暗盒放在将暗盒放在4冰箱冰箱)l四显影四显影(58min)l五定影五定影(15min)l六染色六染色:Giemsa染色液染色染色液染色1015分钟分钟.l七观察与结果分析七观察与结果分析lDNA 3H-TdRlRNA 3H-Ul含含s的的Pr 35S-Met; 35S-CyslPr 3H-MetIle; 14C- MetIle胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2l例题：某种抗癌药物的作用机制是阻止例题：某种

53、抗癌药物的作用机制是阻止肿瘤细胞的肿瘤细胞的DNA复制还是阻止蛋白质合复制还是阻止蛋白质合成，用（成，用（ ）证明。）证明。lA.电镜负染色技术电镜负染色技术 B.放射自显影技术放射自显影技术lC.免疫荧光技术免疫荧光技术 D.免疫电镜技术免疫电镜技术放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行电镜自显影（electron-microscopic autoradiography）。）。电镜自显影照片电镜自显影照片up( (一一) )细胞显微分光光度术细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质

54、（如核酸与利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：包括： 紫外光显微分光光度测定法紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法( (二二) )流式细胞仪流式细胞仪（Flow Cytometry）主要应用：主要应用：用于定量测定细胞中的用于定量测定细胞中的DNADNA、RNARNA或某一特异或某一特异蛋白的含量（判断题形式）蛋白的含量（判断题形式）；测定细胞群体中不同时相；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；

55、分离分离DNADNA含量不同的中期染色体。含量不同的中期染色体。l流式细胞术可用于测定（流式细胞术可用于测定（ ）lA.细胞的大小和特定细胞类群的数量细胞的大小和特定细胞类群的数量lB.分选出特定的细胞类群分选出特定的细胞类群lC.细胞中细胞中DNA、RNA或某种蛋白的含量或某种蛋白的含量lD.以上三种功能都有以上三种功能都有流式细胞分选术流式细胞分选术(fluorescence-associated cell sorting, FACS)激光激光细胞悬液细胞悬液鞘液鞘液液滴加电信号液滴加电信号干涉探干涉探测器测器超声波振摇器超声波振摇器加负电的液滴加负电的液滴加正电的液滴加正电的液滴细胞收集

56、容器细胞收集容器细胞收集容器细胞收集容器废液容器（未探测细胞）废液容器（未探测细胞）up荧光检测器荧光检测器l一、细胞一、细胞培养培养 1、含义、含义 2、意义与应用、意义与应用 3、内容、内容l二、细胞二、细胞工程工程 1、含义、含义 2、意义与应用、意义与应用 3、内容、内容l 对从生物有机体中取出的组织或对从生物有机体中取出的组织或细胞分散成的单个细胞以及单细胞细胞分散成的单个细胞以及单细胞生物给予必要培养条件，使其在培生物给予必要培养条件，使其在培养环境中继续生长与增殖。养环境中继续生长与增殖。l 它是当前细胞生物学及整个生它是当前细胞生物学及整个生命科学研究与生物工程中最基本命科学研

57、究与生物工程中最基本的实验技术。近年来，细胞生物的实验技术。近年来，细胞生物学系列进展都与之紧密相关。学系列进展都与之紧密相关。l它为植物育种、疫苗生产、药物它为植物育种、疫苗生产、药物研制、肿瘤防治提供全新手段，研制、肿瘤防治提供全新手段，为基因工程等现代生物工程提供为基因工程等现代生物工程提供必要条件。必要条件。l（一）原核生物的（一）原核生物的培养培养 l（二）真核单细胞生物的（二）真核单细胞生物的培养培养l（三）动物细胞的（三）动物细胞的培养培养l（四）植物细胞的（四）植物细胞的培养培养l（五）非细胞体系在细胞生物学研究中（五）非细胞体系在细胞生物学研究中 的的应用应用返回返回l它是它

58、是较为简单、较为基础较为简单、较为基础的细胞培养方的细胞培养方式。现代基因工程仍然进行大量的原核式。现代基因工程仍然进行大量的原核生物培养。生物培养。l原核生物培养原核生物培养简便、快速、周期短简便、快速、周期短，培，培养过程中注意养过程中注意防止杂菌防止杂菌污染。污染。上一页上一页l它对揭示细胞基本生命活动的规律具有它对揭示细胞基本生命活动的规律具有重要意义。现代基因工程需要大量培养重要意义。现代基因工程需要大量培养真核单细胞生物。真核单细胞生物。l真核单细胞生物培养真核单细胞生物培养简便、快速、周期简便、快速、周期短短，培养过程中注意，培养过程中注意防止杂菌防止杂菌污染。污染。上一页上一页

59、1、培养类型、培养类型（1）原代细胞原代细胞培养培养 （2）传代细胞传代细胞培养培养2、培养、培养方法方法：动物体：动物体组织块组织块剪碎剪碎 酶液处理酶液处理（胰酶或胶原酶）（目的：消化分散细胞）（胰酶或胶原酶）（目的：消化分散细胞） 营养营养液培养（适宜温度、液培养（适宜温度、pH值、无菌）（营养液加入值、无菌）（营养液加入小小牛血清牛血清，目的：适宜细胞贴壁生长与分裂），目的：适宜细胞贴壁生长与分裂）l天然、合成和无血清培养基。天然、合成和无血清培养基。l 、天然培养基：天然培养基：l血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。l 、合成培

60、养基：合成培养基：l优点优点:成分明确、组分稳定、可大量生产供应。成分明确、组分稳定、可大量生产供应。l目前采用的有目前采用的有:BME 、 MEM 、 DMEM 、 HAM F12 、 RPM11640 、 ISOCOV 、 199和和McCoy5A等等.l(1)氨基酸氨基酸 l作用作用:是细胞合成蛋白质、维持细胞生命不可缺少的是细胞合成蛋白质、维持细胞生命不可缺少的物质物质.l种类种类:Arg 、Val、His 、Ile 、 Leu 、 Lys 、 Met 、 Phe 、 Thr 、 Trp 、 Tyr 和胱氨酸和胱氨酸.l此外还有此外还有谷氨酰胺谷氨酰胺.它几乎是所有细胞的重要的碳源它几