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文档简介

1、实验十五 重组子的筛选技术 蓝白斑筛选法【实验目的】 学习蓝白斑法筛选重组菌落的原理及具体的实验操作过程。【实验材料】 移液器及吸咀 培养皿 接种环 1.5mL离心管 恒温培养箱水浴锅LB液体培养基 蛋白胨 8g 氯化钠 7g 酵母 5g 定容至1000mL，用NaOH调pH至7.57.6，可置-20保存，高压灭菌LB固体培养基 液体培养基中加入1.5%的琼脂，15磅30分钟高压灭菌后使用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖) X-gal溶于N, N-二甲基甲酰胺中配20mg/mL原夜，-20避光保存IPTG(异丙基-D-半乳糖苷) 0.2g/mL分装，贮存于-20氨苄青霉素(Am

2、picillin) 1g Ampicillin溶于5mL灭菌水中，配成母液，保存于-20转化菌【实验原理】 -半乳糖苷酶是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，最常用的-半乳糖苷酶基因来自大肠杆菌lac操纵子，它们使载体中带有大肠杆菌lac操纵子的调节序列和编码-半乳糖苷酶N末端146个氨基酸的序列。用异丙基-D-半乳糖苷(IPTG)可诱导这个末端片段的合成，合成的片段能与宿主编码的-半乳糖苷酶缺陷型进行互补，恢复该酶的活性，这一过程称为-互补。 由于克隆用载体pGEM-T Easy Vector带有lacZ的调节序列和-半乳糖苷酶的部分编码序列，可以与缺陷型宿主DH 5在诱导物IPTG存在下，

3、形成-互补，宿主菌在含色素底物X-gal的培养基平板上形成蓝斑；在有外源DNA片段插入到载体多克隆位点时，就使载体编码-半乳糖苷酶的部分序列失活，带有重组质粒的宿主菌产生白斑。为提高筛选的准确性，实验中采取蓝白斑筛选法。【实验原理】 IPTG可诱导缺陷型大肠杆菌DH 5表达出半乳糖苷酶，该酶可分解添加于培养基中无色的X-gal成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-靛蓝，使菌落呈现出蓝色反应；在T质粒载体lacZ序列中，含有一系列不同限制酶的单一识别位点，其中任何一个位点插入了外源克隆DNA片段，都会阻断半乳糖苷酶的读码结构，使其编码的肽失去活性，结果产生出白色的菌落。因此，根据这种半乳糖苷酶的显色反应，便可检测出含有外源DNA插入序列的重组克隆。【实验步骤】1、平板的准备 在40uL X-gal中加入4uL IPTG，充分混合，在无菌条件下涂布于含Amp(浓度为50ug/mL)的LB平板上，将平板置于37恒温箱中23hr，以使培养基充分吸收色素底物X-gal；2、涂板 将转化菌在无菌条件下涂布于含抗生素和X-gal、IPTG的平板上，正面朝上放置30分钟，待菌液完全被吸收后倒置平板，37培养1218hr；3、观察实验结果蓝白斑筛选重组菌落蓝

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