菌种选育理论与技术

1、第二章第二章 菌种选育理论与技术菌种选育理论与技术微生物工业化发酵生产中，决定生产水平高低的主要有微生物工业化发酵生产中，决定生产水平高低的主要有三个方面：三个方面：菌种选育（菌种选育（strain improving）、发酵工艺、发酵工艺（fermentation techniques）和分离提取工艺）和分离提取工艺（separation and extraction techniques）菌种选育的最初目的是改良菌种的特性，使其符合工业菌种选育的最初目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产要求。生产要求。开发新的抗生素品种。开发新的抗生素品种。菌种选育是一门应用科学技术菌种选育是一门应用科学

2、技术理论基础：微生物学、微生物遗传学、生物化学、理论基础：微生物学、微生物遗传学、生物化学、分子生物学、基因工程等。分子生物学、基因工程等。目的目的简化生产工艺条件，缩短生产周期简化生产工艺条件，缩短生产周期 研究抗生素生物合成调控的机制研究抗生素生物合成调控的机制分析抗生素生物合成途径分析抗生素生物合成途径获得带遗传标记的菌株获得带遗传标记的菌株了解菌种遗传背景了解菌种遗传背景改变产品组分、改进质量条件改变产品组分、改进质量条件抵抗不良培养条件抵抗不良培养条件适应新的原材料适应新的原材料提高产量提高产量提供分子遗传学研究材料提供分子遗传学研究材料产生新的生物活性物质产生新的生物活性物质青霉素

3、生产菌种的选育目前工业发酵水平目前工业发酵水平经诱变经诱变85000 UmlWisQ176，900 Uml产黄青霉，产黄青霉，20 Uml点青霉，点青霉，2 Uml1943年，发霉的甜瓜年，发霉的甜瓜1928年，年，Fleming菌种选育的基本方法菌种选育的基本方法根据菌种根据菌种自然变异自然变异而进行而进行的的自然选育自然选育。用用人工方法人工方法引起菌种变异或形成新的杂种，再按引起菌种变异或形成新的杂种，再按照照工业要求工业要求进行筛选来获得进行筛选来获得新的变种或杂种新的变种或杂种。 包括诱变育种，杂交育种，原生质体育种，包括诱变育种，杂交育种，原生质体育种，基因工程育种等。基因工程育种

4、等。第一节第一节 自然选育自然选育自然选育（自然选育（natural screeningnatural screening） 是是指利用微生物在一定条件下产生自发突指利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产菌株的过程，以达到中选出维持或高于原有生产菌株的过程，以达到稳定或提高生产的目的。稳定或提高生产的目的。自然选育的目的自然选育的目的 淘汰淘汰衰退菌种，保存优良菌株，纯化菌种，衰退菌种，保存优良菌株，纯化菌种，防止菌种衰退，稳定生产，提高发酵产量。防止菌种衰退，稳定生产，提高发酵产量。一、菌种

5、衰退的原因一、菌种衰退的原因菌种遗传特性菌种遗传特性的改变的改变经诱变剂处理后的退化变异经诱变剂处理后的退化变异 菌种生理状况的改变菌种生理状况的改变 （培养条件）（培养条件） 导致衰退可能的原因：沙土管长期保藏、连续传代、导致衰退可能的原因：沙土管长期保藏、连续传代、新陈代谢产生的诱变物质、多因素低剂量诱变效应、互新陈代谢产生的诱变物质、多因素低剂量诱变效应、互变异构现象等。变异构现象等。二、自然选育的一般过程生产菌种斜面制备单孢子悬浮制备单孢子悬浮液液分离出单菌落分离出单菌落斜面种子（初筛斜面种子（初筛斜面）斜面）摇瓶初筛摇瓶初筛高产菌株高产菌株沙土管菌株沙土管菌株斜面种子斜面种子摇瓶复筛

6、摇瓶复筛高产纯化菌高产纯化菌株株放大试验放大试验进一步选育或保藏进一步选育或保藏1、单孢子悬浮液的制备、单孢子悬浮液的制备定量稀释后制成定量稀释后制成50200个单细胞个单细胞ml的菌悬的菌悬液。液。2、分离及单菌落培养、分离及单菌落培养 根据计数结果，按丝状真菌、放线菌菌落大根据计数结果，按丝状真菌、放线菌菌落大小不同，分离量以小不同，分离量以520个菌落平皿为宜。个菌落平皿为宜。 3、筛选、筛选将分离培养后的各型单菌落，接斜面培养，将分离培养后的各型单菌落，接斜面培养，成熟后接入发酵瓶，测定发酵单位的过程称为筛选。成熟后接入发酵瓶，测定发酵单位的过程称为筛选。它分初筛、复筛两个过程。它分初

7、筛、复筛两个过程。 优点优点简单易行简单易行缺点缺点效率低，进展慢，难以获得高产突变株效率低，进展慢，难以获得高产突变株以微生物的自然变异为基础的生产选种几率并不以微生物的自然变异为基础的生产选种几率并不是很高，一个基因的自然突变频率仅是很高，一个基因的自然突变频率仅1061010目的目的纯化、复壮菌种纯化、复壮菌种第二节第二节 诱变育种诱变育种诱变育种（诱变育种（mutation breeding）是利用物理或化学）是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其突变率大幅提高，然后采用简便、高效的筛选方突变率大幅提高，然后采用简便、高效的

8、筛选方法，从中选出少数具有优良性状的突变菌株。法，从中选出少数具有优良性状的突变菌株。优点：速度快，收效大，方法简便。优点：速度快，收效大，方法简便。缺点：诱发突变缺乏定向性，工作量大。缺点：诱发突变缺乏定向性，工作量大。诱变育种工作主要包括出发菌株的选择、诱变处诱变育种工作主要包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株三个部分。理和筛选突变株三个部分。出发菌种(沙土管或冷冻管) 原种特性考察 斜面 或肉汤培养 24h 单孢子悬液 细菌悬液 诱变处理 处理前后的孢子液或细菌悬液作活菌计数并统计其存活率 稀释涂布平皿 观察单菌落形态并统计其形态变异率 挑取单菌落传种斜面 摇瓶初筛 对照组 挑出高产

9、斜面 传种斜面 摇瓶复筛(重复 35 次) 对照组 挑出高产菌株作稳定性试验和菌种特性考察 放大中试考查，保藏菌种 大型投产试验 出发菌株（沙土管或冷冻管）诱诱变变育育种种的的一一般般步步骤骤一、诱变剂的种类一、诱变剂的种类物理诱变剂：主要包括物理辐射中的各种射线物理诱变剂：主要包括物理辐射中的各种射线化学诱变剂：与化学诱变剂：与DNA发生作用、改变其结构，并发生作用、改变其结构，并引起遗传变异的化学物质。引起遗传变异的化学物质。生物诱变剂：一些能引起生物诱变剂：一些能引起DNADNA结构改变，从而造成结构改变，从而造成突变效应的生物体或生物分子。突变效应的生物体或生物分子。 超超净工作台净工

10、作台小型小型X X射线衍射仪射线衍射仪CoCo6060射线机射线机二、诱变育种的过程二、诱变育种的过程前突变：诱变剂所造成的前突变：诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的分子的某一位置的结构改变。结构改变。 突变：由于染色体或基因本身的变化而产生的遗突变：由于染色体或基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。传性状的变异。表型延迟：表型改变落后于基因型改变的现象表型延迟：表型改变落后于基因型改变的现象。 （一）诱变剂接触（一）诱变剂接触DNADNA分子前分子前1 1、细胞对诱变剂的透性将影响诱变效果。、细胞对诱变剂的透性将影响诱变效果。2 2、细胞质的某些组分和某些酶可和诱变剂相互作、细胞质的某些组

11、分和某些酶可和诱变剂相互作用而影响诱变效果。用而影响诱变效果。3 3、与基因所处的状态有关，而基因的状态又和培、与基因所处的状态有关，而基因的状态又和培养条件有关。养条件有关。 （二）（二）DNA损伤修复损伤修复光修复作用（光复活作用）光修复作用（光复活作用）切补修复切补修复 四种酶的作用：核酸内切酶四种酶的作用：核酸内切酶 、核酸外、核酸外 切酶切酶 、DNA多聚多聚酶酶 、DNA连接酶连接酶重组修复重组修复SOS修复系统修复系统DNA聚合酶的矫正作用聚合酶的矫正作用（三）前突变到突变的过程（三）前突变到突变的过程校正差错：光复活作用、切补修复和校正差错：光复活作用、切补修复和DNA多聚酶校

12、正多聚酶校正作用作用 引起差错：重组修复和引起差错：重组修复和SOS修复系统修复系统 一切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由一切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由前突变向突变转变这一过程前突变向突变转变这一过程 。诱变前后的处理可影响诱变的效果诱变前后的处理可影响诱变的效果 ：1、通过影响与、通过影响与DNA修复作用有关的酶的活性而影响修复作用有关的酶的活性而影响诱变的效果；诱变的效果；2、通过使诱变的目的基因处于活化状态、通过使诱变的目的基因处于活化状态(复制或转录复制或转录状态状态)，使之更容易被诱变剂所作用，从而影响目的，使之更容易被诱变剂所作用，从而影响目的基因的突变率

13、。基因的突变率。 ( (四四) )从突变到突变型从突变到突变型1 1、分离性迟延、分离性迟延是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态态( (野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中) )，突，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态过复制、分离，在细胞中处于纯的状态( (一细胞中只有一细胞中只有突变型基因，没有野生型基因突变型基因，没有野生型基因) )时，其性状才得以表达。时，其性状才得以表达。2 2、生理性迟延、生理性迟延突变基

14、因由杂合状态变为纯合状态时，还不一突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因的产物定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。稀释到某一程度后才能表现出来。 三、诱变育种的步骤三、诱变育种的步骤q出发菌株的选择出发菌株的选择q处理菌悬液的制备处理菌悬液的制备q诱变处理诱变处理q中间培养中间培养q突变株的分离和筛选突变株的分离和筛选四、突变株的筛选四、突变株的筛选(一一)随机筛选随机筛选(二二)理性化筛选（定向筛选）理性化筛选（定向筛选）运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生

15、物合成途径、代谢调控机制和产知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。成产物的高产突变株。1 1、 初级代谢产物高产菌株的筛选初级代谢产物高产菌株的筛选普遍存在着反馈抑制和反馈阻遏，要打破反馈调节系统，普遍存在着反馈抑制和反馈阻遏，要打破反馈调节系统，可从两个方面着手：可从两个方面着手： (1)(1) 筛选筛选细胞膜透性改变的突变株细胞膜透性改变的突变株例如，谷氨酸发酵选育的高产菌株为谷氨酸棒杆菌例如，谷氨酸

16、发酵选育的高产菌株为谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型。的生物素营养缺陷型。（2 2）筛选）筛选营养缺陷型营养缺陷型突变株突变株 营养缺陷型营养缺陷型: :诱变产生的缺乏合成某些营养物诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能力，须在基本培养基中加入相应的营质的能力，须在基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。养成分才能正常生长的变异株。 野生型野生型: :与营养缺陷型对应的是野生型。与营养缺陷型对应的是野生型。 渗漏缺陷型渗漏缺陷型: :是遗传性障碍不完全的营养缺陷是遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，能少量地合成某一代

17、谢产物。丧失，能少量地合成某一代谢产物。(2)(2)筛选结构类似物抗性突变株筛选结构类似物抗性突变株结构类似物结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物物质质2 2、次级代谢产物、次级代谢产物( (主要是抗生素主要是抗生素) )高产菌株的筛选高产菌株的筛选利用营养缺陷型筛选利用营养缺陷型筛选 筛选负变株或零变株的回复突变株筛选负变株或零变株的回复突变株 筛选去磷酸

18、盐调节突变株筛选去磷酸盐调节突变株 筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 筛选二价金属离子抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选自身所产的抗生素抗性突变株筛选自身所产的抗生素抗性突变株1 1、抗性筛选、抗性筛选抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有10106 6频率频率的突变体存在，就容易筛选出来的突变体存在，就容易筛选出来抗性突变株的筛选常用的有抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法和阶梯性一次性筛选法和阶梯性

19、筛选法筛选法两种手段两种手段（三）理性化筛选的方法（三）理性化筛选的方法（1 1）一次性筛选法）一次性筛选法一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株中，一次性筛选出少量抗性变异株u 抗噬菌体菌株筛选抗噬菌体菌株筛选u耐高温菌株筛选耐高温菌株筛选u耐高酒精度、高渗透压耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得渗环境下一次性筛选获得（2 2）阶梯性筛选法）阶梯性筛选法无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物无法知道微生物究竟能耐受多少

20、高浓度的药物药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的 梯度平板法梯度平板法 纸片扩散法纸片扩散法吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构 梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，以提高相应代谢产物的产量。选，以提高相应代谢产物的产量。如：吡哆醇高产菌株筛选如：吡哆醇高产菌株筛选u 梯度平板法梯度平板法(Gradient plate)(Gradient plate) 纸纸片扩散法与梯度平板法片扩散法与梯度平板法的原理类似，用打孔器将较的原理类似，用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，

21、并使厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般布了菌悬液的平板上，一般9 9厘米的培养皿中等距放置厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。出现的可能就是抗性菌。u 纸片扩散法 阶梯性筛选法的缺点 阶梯性筛选法只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。 2 2、营养缺陷型突变株筛选、营养缺陷型突

22、变株筛选基本培养基（基本培养基（MMMM，minimal mediumminimal medium）：）：能满足某一菌能满足某一菌种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基养基补充培养基（补充培养基（SMSM，supplemental mediumsupplemental medium）：）：在基本在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基不能生长）的培养基完全培养

23、基（完全培养基（CMCM，complete mediumcomplete medium）：）：可满足该菌各可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法1)1)淘汰野生型淘汰野生型p抗生素法：抗生素法：将诱变处理液在将诱变处理液在MMMM中培养短时让野生型处于活化阶段，中培养短时让野生型处于活化阶段，而缺陷型而缺陷型处于休眠状态处于休眠状态且在培养基中加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被且在培养基中加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型杀死，保存了缺陷型p菌

24、丝过滤法：菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而保留在处理液中丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而保留在处理液中2)2)检出缺陷型检出缺陷型原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在不同，缺陷型在CMCM上生长良好，而在上生长良好，而在MMMM上则不生长，野生上则不生长，野生型都能生长型都能生长也称任意法也称任意法用接种针或牙签将用接种针或牙签将CMCM上长出的菌落在上长出的菌落在MMMM和和CMCM两副平板上

25、两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生接种，依次在相应位置点种，然后一起培养，观察其生长情况长情况此法结果明确，但工作量大此法结果明确，但工作量大 点种法点种法先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的含菌的MMMM，凝固后再倒一薄层，凝固后再倒一薄层MMMM琼脂培养基，培养琼脂培养基，培养24h24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层将出现的菌落标记，然后倒上一层CMCM琼脂培养基，再培琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷

26、型菌落从夹此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易层中挑出并不很容易 夹层法夹层法3)3)营养缺陷型生长谱的确定营养缺陷型生长谱的确定方法二方法二以不同组合的营养混合物与融化凉至以不同组合的营养混合物与融化凉至5050的的MMMM培养基混合铺培养基混合铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子应位置，培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子在在5 56 6个平皿上可测个平皿上可测2020株菌以上。株菌以上。第三节第三节 杂交育种杂交育种杂交育种是指将两个基因

27、型不同的菌株经吻合杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合(或接合或接合)使遗传物质使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。杂交育种的目的在于：杂交育种的目的在于：（1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株(重组体重组体)；（2）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；长期用诱变剂处理造成的菌