间充质干细胞定向成骨细胞分化的蛋白质组学分析

1、间充质干细胞定向成骨细胞分化的蛋白质组学分析         07-08-23 09:26:00     作者：刘元林,于晓    编辑：studa20【关键词】  蛋白质组学；间质干细胞；蛋白表达Proteomic analysis of human bone marrowderived mesenchymal stem cells induced to differentiate into osteoblasts【Abst

2、ract】 AIM: To analyze the difference of protein profiles between human bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) and osteogenic differentiated MSCs by proteomic approach. METHODS: The MSCs were isolated primarily from bone marrow of adults and detected in cell purity by flow cytometry analyzi

3、ng cell phenotypes and in cell function by multilineage potential test. The undifferentiated MSCs and osteogenic differentiated MSCs over a period of 14 d were collected and cell total proteins were extracted for finding out the differential expression by proteomic analysis including 2D gel electrop

4、horesis and Peptide Mass Fingerprinting technology. RESULTS: Twentythree differentially expressed proteins were identified by MALDITOFMS analysis. CONCLUSION: Proteomic approach is a high throughput method to screen the key proteins which play important roles in MSCs osteogenic differentiation.【Keyw

5、ords】 proteomics; mesenchymal stem cells; protein expression【摘要】 目的: 探讨用蛋白质组学方法分析人骨髓间充质干细胞（MSCs）定向成骨细胞诱导分化中细胞蛋白表达谱的改变. 方法: 从人骨髓细胞中分离获得MSCs，经细胞表型及多向分化能力测定鉴定MSCs的纯度和功能后，采用定向成骨细胞分化诱导培养体系，于分化后14 d分别提取未分化细胞及分化后细胞的总蛋白，双向电泳分析，确定蛋白差异点，经酶切后行蛋白肽质量指纹谱鉴定差异蛋白表达. 结果: 双向电泳找到38个蛋白差异点，质谱分析鉴定出23个差异蛋白分子表达. 结论: 用蛋白质组学方

6、法可高通量筛选与MSCs定向诱导成骨细胞分化相关的重要蛋白.【关键词】 蛋白质组学；间质干细胞；蛋白表达0引言间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一群具有向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化能力的干细胞，存在于成体的骨髓、骨、脂肪和肌肉等组织中. MSCs体外贴壁性使之易于分离纯化，且体外培养的MSCs增殖能力强，是一种具有重要应用价值的种子细胞1. 但有关MSCs定向分化的分子机制尚不清楚. 为探讨MSCs定向成骨分化过程中细胞内可能具有调控作用的蛋白分子的变化，我们首先从人骨髓单个核细胞中分离获得MSCs，对所获得的MSCs进行了细胞表型及多向分化能力

7、测定，在鉴定MSCs的纯度和功能后，采用定向成骨分化诱导培养体系诱导MSCs定向成骨细胞分化，对未分化MSCs及分化后细胞总蛋白进行提取，经双向电泳比较蛋白差异点，选择差异点蛋白，酶切后进行蛋白点肽质量指纹谱鉴定分析.1材料和方法1.1材料骨髓取自食道癌手术患者，年龄5667岁. 主要试剂Dulbeccos modified Eagles medium（DMEM）培养基为Gibco产品，胎牛血清为Stem cell产品，Percoll为Amersham Pharmacia产品，CD34，CD45，CD73，CD105，CD166单克隆抗体为BD公司产品，胰酶、地塞米松、甘油磷酸钠、抗坏血酸、碱

8、性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色试剂盒、CHAPS为Sigma产品，IPG干胶条(pH310,18 cm)为Amersham Pharmacia产品，碘乙酰胺为Fluka产品，标准蛋白BSA为Pierce产品，其他试剂由本室提供.1.2方法1.2.1人骨髓MSCs的分离培养Percoll分离人骨髓单个核细胞，2×105细胞/cm2密度接种于塑料培养瓶中，培养体系为含100 mL/L经筛选胎牛血清的高糖DMEM，48 h后去除非贴壁细胞，每隔3 d换液，至贴壁细胞0.80融合时按3000细胞/cm2接种传代.1.2.2人骨髓MSCs的鉴定收集3代以后的

9、细胞，按1 L/1×106细胞分别加入PE或FITC直接标记的抗CD34，CD45，CD73，CD105和CD166等单克隆抗体，室温反应20 min. PBS洗涤后,流式细胞仪检测,每个反应至少收集5000个点数据. 以加入相应同型抗体细胞作为阴性对照，应用相关软件分析2-3. 按照文献方法4诱导MSCs向成骨细胞分化，用ALP染色鉴定；诱导MSCs向脂肪细胞分化，用油红染色鉴定；诱导MSCs向成软骨细胞分化，阿尔辛蓝染色鉴定.1.2.3双向电泳1.2.3.1双向电泳蛋白质样品的制备收集3代以后的MSCs和向成骨诱导分化的细胞，用冷的PBS洗2遍后，加入细胞裂解液(8 mol/L尿

10、素，40 g/L CHAPS，40 mmol/L Tris base)，混匀后用液氮反复冻融，再加入适量RNA酶和DNA酶，冰浴20 min. 4离心(14 000 g,30 min)，取上清，Bradford法定量，分装，-70保存.1.2.3.2第一向固相PH梯度等电聚焦（IEF）100 g（银染）或1 mg（考染）蛋白与重泡涨液（8 mol/L尿素，20 g/L CHAPS，5 L/L IPG缓冲液，20 mmol/L DTT，痕量溴酚蓝）混合，行等电聚焦，重泡涨与等电聚焦在16，以设定程序进行，总电压时间为80 000 Vh.1.2.3.3平衡等电聚焦结束后，每根IPG胶条用8 mL含SDS的平衡液（50 mmol/L TrisCl (pH 8.8)，6 mmol/L尿素，300 mL/L甘油，20 g/L SDS，痕量溴酚蓝）平衡两次，每次15 min，第一次为还原过程，平衡液内加20 mmol/L DTT；第二次平衡为烷基化过程，平衡液内加100 mmol/L的碘乙酰胺.1.2.3.4第二向垂直平板电泳（SDSPAGE）将平衡好的IPG胶条转移至130 mL/L的丙烯酰胺胶上分离，碱性端旁置蛋白分子量Marker，行SDSPAGE.1.2.3.5染色及凝胶图像采集分析S