杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞定向分化蛋白质组学研究

1、杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞定向分化蛋白质组学研究         10-08-25 15:29:00     编辑：studa20                   作者：曾建春 樊粤光 刘建仁 易春智 阎亮【摘要】  目的研究杜仲含药血清诱导骨髓间充质干细胞 (Mesenchym

2、al stem cells,MSCs) 向成骨细胞定向分化过程的蛋白表达差异，分析杜仲诱导MSCs向成骨细胞分化的可能调控机制。方法对杜仲含药血清干预前、干预后第2天、第7天，第14天的细胞提取总蛋白，通过双向电泳分离、PDQuest-7.3.0胶图分析软件进行分析找出差异蛋白，并进行质谱分析、数据库查询建立功能蛋白质组。结果双向电泳分离得到641个蛋白点，选取其中75个点进行质谱分析，经数据库查询得到6个功能蛋白。结论实验认为补肾中药杜仲可能通过上调波形蛋白、核纤层蛋白A的表达促进细胞分化，下调钙网织蛋白表达，释放细胞内钙，参与钙结节的形成，与体内骨矿化过程有关。过氧化物歧化酶、膜联蛋白A6

3、与细胞的活力有关，调节着细胞的分裂增殖与分化，但是否与定向成骨细胞分化有着密切关系尚有待进一步研究。 【关键词】  杜仲骨髓间充质干细胞蛋白质组学双向电泳Abstract:ObjectiveTo study the protein change in the process of MSCs differentiation to osteoblas guiding by blood serum containing Duzhong（Cortex Eucommiae）, and its  possible regulation mechanisms.MethodsTotal p

4、rotein of cells interfered by blood serum containing Duzhong（Cortex Eucommiae）for 0day, 2days, 7days,14days, was extracted, runouted by two-dimensional electrophoresis and searched for different protein spot by PDQuest-7.3.0 software for analyzing gel picture.Functional proteome was established by m

5、ass chromatographic analysis and data base querying. Results641 protein spots were obtained, chose 75 spots to receive mass chromatographic analysis, and 6 functional protein were obtained by data base querying.ConclusionChinese drug Duzhong（Cortex Eucommiae）may up-regulate  express of  vi

6、mentin and lamin A to promote cell differentiation, down-regulate express of calreticulin to release intracellular Ca2+ which is related to Ca- nodus and bone mineralization in bodies. SOD and annexin A6 are concerned with corpuscular vigor, regulate corpuscular division growth and differentiation,

7、but whether they have intimate relation with directional differentiation from MSCs to osteoblast is unknown, waiting for further research.Key words:Duzhong（Cortex Eucommiae）；  MSCs；  Proteome；  Two-dimensional electrophoresis    骨髓间充质干细胞（MSCs）是一种多功能干细胞，在不同条件下可向成骨细胞、软骨细胞

8、、心肌细胞等分化。中医学认为，肾藏精，主骨，生髓，经前期研究发现，杜仲含药血清能够诱导MSCs向成骨细胞分化并促进细胞增殖，但对于MSCs向成骨细胞分化这一复杂过程的机制缺乏相关研究。    蛋白质组学研究是后基因组学时代又一重要研究工具，已经广泛应用到生命科学各个领域。本文建立补肾中药杜仲含药血清干预 MSCs体外定向分化为成骨细胞过程，采用蛋白组学技术分析MSCs分化过程中不同时间点蛋白表达的变化情况，从蛋白质分子水平上解释杜仲干预 MSCs分化的可能机理。1  器材1.1  动物SPF SD大鼠2只，体质量150200 g，雌雄不限，由广

9、州中医药大学实验动物中心提供。1.2  试剂L-DMEM培养基、南美洲胎牛血清（FBS、海克隆），杜仲（产地云南），0.25%胰酶（GIBCO公司），矿物油、标准蛋白、CHAPS、DTT、Indoacetamide（sigma），尿素（BBI），硫脲（天津市化学试剂一厂），PH3-10两性电解质（Bio-Rad），考马斯亮蓝 ( G2 250、R2 250 )、低熔点琼脂糖、苯甲基磺酰氟( PMSF)、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基磺酸钠 ( SDS)、溴酚蓝、甘油、无水碳酸钠、硫代硫酸钠、 三氟乙酸(TFA)、无水甲醇、无水乙醇、冰

10、醋酸为国产分析纯，购于广州威佳公司。1.3  器材25，75，175 cm2培养瓶（Coning），酶标仪（Thermo），CO2培养箱 (Heraeus)，注射器针头滤器，0.22 m滤膜（MILLIpore），SIGMA-3K15离心机（sigma），双向电泳仪器：Multiphor II（Amersham）、Protean II xi cell（Bio-Rad），IPG固相胶条（17cm，PH：3-10，Bio-Rad），PDQuest凝胶分析软件( 7.3.0版本) (美国Bio- Rad公司)、 Power look 2100XL凝胶图像扫描仪(美国UMAX公司)、质谱仪器

11、4700 proteomics Analyzer（ABI公司），超低温冰箱（SANYO）。2  方法2.1  杜仲含药血清的制备取杜仲药材粗粉150 g，加70%乙醇10倍量，加热回流两次，1 h/次，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至300 ml，室温冷却，4冰箱保存备用。将中药药液稀释至0.3 g生药/ml灌胃，1 ml/次，2次/d，连续给药4 d，最后一次给药后1 h经腹主动脉采血，室温静置3 h后置4冰箱过夜，2 500 r/min离心20 min，收集上清液，针头滤器过滤除菌，置-20保存备用。2.2  MSCs 分离、纯化、扩增、诱导SD大鼠以10%水合

12、氯醛0.7 ml经腹腔麻醉后，75%酒精浸泡颈部以下躯体5 min，无菌条件下取出双下肢股骨和胫骨，修洁软组织后，咬骨钳修剪骨端，暴露髓腔，10 ml注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培养基反复冲洗髓腔，至到骨质外观微微透亮。25 cm2培养瓶收集骨髓冲洗液，放37、5%CO2孵箱培养，每3天换液1次。当原代长满瓶底90%以上时0.25%胰酶消化后11传代至75 cm2培养瓶，当细胞长满75 cm2培养瓶时，以0.25%胰酶消化后12传代至长满4瓶75 cm2培养瓶，再以11传代至175 cm2培养瓶，当细胞长满瓶底80%时其中3瓶加入含10%杜仲血清的L-DMEM，余下的一瓶细胞立即0

13、.25%胰酶消化后收集细胞，并分别于诱导后第2天、第7天、第14天同法收集细胞，置-80保存备用。2.3  细胞总蛋白的提取及定量细胞解冻后用10 mmol/L Tris/250 mmol/L Srirose（pH 7.0）洗涤3次，加入2 ml裂解液8 mol/L 尿素，4%（W/V）CHAPS，65 mmol/L DTT，2%PHarmalyte-10混匀，加50 g/ml RNase及200 g/ml Dnase，在4放置15 min，再14 000 r/min，4离心30 min，上清bradford法测浓度，-80保存。2.4  第1向等电聚焦从冰箱中取出IPG预

14、制胶条，用溶胀缓冲液（8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.5CHAPS,0.52%两性电解质，0.02溴酚蓝，1DTT）将胶条泡胀12 h。将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，上样量为0.6 mg，并用溶胀buffer稀释至190 l。对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序（表1）。聚焦结束的胶条，立即进行平衡，第2向SDS-PAGE电泳。表1  等电聚焦程序（略）2.5  胶条平衡将胶条放入平衡缓冲液I（50 mmol/L Tris-HCl 6.8，6 mol/L尿素，30甘油，2% SDS，2 DTT，0.02 溴酚蓝）水平振荡15 min，再将胶

15、条转入平衡缓冲液II（50 mmol/L Tris-HCl 6.8，6 mol/L 尿素，30甘油，2% SDS，2.5IAA，0.02 溴酚蓝）水平振荡15 min。2.6  第2向聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳胶条平衡之前配制丙烯酰胺凝胶4块，分离胶浓度为12%配制如表2。表2  聚丙烯酰胺凝胶的配置（略）    第2次平衡结束后，将IPG胶条从样品水化盘中移出，放到已配好的SDS-PAGE凝胶上端，并将marker（分子量为97，66，45，30，20.1和14.4 kDa）放到凝胶的一端，再用0.5的琼脂糖将胶条和marker封

16、严，切忌不能产生气泡。并将胶板固定于电泳槽内。向电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，100 V恒压电泳至溴酚蓝条带全部进入分离胶后调电压至120150 V恒压电泳56 h，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，进行染色。2.7  考马斯亮蓝染色将凝胶放入装有染色液（10硫酸铵，10磷酸，0.12G250，20甲醇）的水平盘内，并将水平盘置水平摇床上水平振荡过夜。收集染色液，将凝胶浸于脱色液（3冰醋酸溶液）中，水平摇床振荡。最后换成MQ再洗涤30 min。2.8  图像分析及蛋白鉴定图像分析及蛋白鉴定：染色后的凝胶用水洗净后，采用扫描

17、仪进行扫描成像，扫描分辨率设为300 dpi。考染图像分析采用PDQuest软件 (Bio-Rad)进行分析；分析过程包括点检测和编辑、建立和编辑比较组、比较组的数据分析及点的计数和解释等，具体方法参照软件操作说明进行。通过对分析胶的对比分析，可以找出比较组中表达呈现差异的蛋白点，这些差异蛋白点在考染凝胶中的对应蛋白斑点将作为质谱分析对象。    对目标蛋白点进行胰蛋白酶酶切，提取多肽混合物。取0.3 l肽段提取液，与等体积-氰基- 4-羟基肉桂酸饱和的0.1TFA/50乙腈溶液混合后点于质谱仪的96孔不锈钢靶上。按照说明进行操作。3  结果    经bradford法测定各组总蛋白浓度分别为0 d 3.24