不同浓度地塞米松对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

1、不同浓度地塞米松对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响         10-05-12 16:45:00     编辑：studa20             作者：庞金辉，黄煌渊，张权，纪斌，曹成福 【摘要】  目的 观察不同浓度地塞米松对体外培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs)成骨分化、增殖能力及凋亡率的影响。方法 以梯度密度分离法获

2、取人骨髓间充质干细胞进行体外培养，以1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L 4种不同浓度地塞米松分别处理细胞。检测各组细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性；RTPCR法检测骨桥蛋白(OPN)基因的表达；四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定各组细胞的增殖率；流式细胞仪分析细胞凋亡率。结果 低浓度(1×10-9mol/L)地塞米松对ALP的表达无显著作用(P>0.05)，而1×10-8mol/L及以上浓度的地塞米松可明显增加ALP的活性(P<0.01)；所有实验组的hMSCs均有OPN mRNA表达，其表达强

3、度随着地塞米松浓度增加而增强；1×10-9mol/L地塞米松对细胞增殖无明显影响(P>0.05)，1×10-8mol/L及以上浓度的地塞米松可明显抑制细胞的增殖(P<0.01)；体外培养的hMSCs凋亡率随地塞米松浓度的增加而升高 (P<0.01)。结论 1×10-8mol/L及以上浓度的地塞米松可显著增强hMSCs成骨分化能力，同时抑制细胞增殖并促进其凋亡。 【关键词】  间充质干细胞；地塞米松；碱性磷酸酶；骨桥蛋白；细胞增殖；凋亡    Abstract：  Objective  T

4、o observe the effect of dexamethasone on the biological characteristics of human mesenchymal stem cells (hMSCs) derived from bone marrow in vitro.Methods  The primary hMSCs were isolated and cultured in vitroIn subcultures，hMSCs were respectively treated with four different concentrations of de

5、xamethasone(1×10-9,1×10-8,1×10-7 and 1×10-6mo1/L)The alkaline phosphatase(ALP) activity was measured；mRNA of osteopontin was observed by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RTPCR);the proliferation of hMSCs was evaluated by MTT assay；apoptosis was examined with flow c

6、ytometer.Results  Treatment of cells with high concentration of dexamethasone(1×10-8,1×10-7 and 1×10-6mo1/L) for 8 days led to a significant increase in ALP activity(P<0.01)The osteopontin mRNA was induced by different concentration of dexamethasone respectivelyThe optical den

7、sity value of hMSCs treated with high concentration of dexamethasone for 6 days was significantly lower than that of the controls(P<0.01)Dexamethasone increased the apoptosis rate of all hMSCs cultured in vitroConclusion  The high concentration of dexamethasone(1×10-8,1×10-7 and 1&

8、#215;10-6mol/L) induces the differentiation of hMSCs to osteoblastic cells,inhibits the proliferation of cells and leads to an increase of its apoptosis rate    Key words：mesenchymal stem cells；dexamethasone；alkaline phosphatase；osteopontin；cell proliferation；apoptosis  

9、0; 骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)是近年来骨组织工程和干细胞研究的热点种子细胞之一。目前已知，地塞米松可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，但是地塞米松对骨髓间充质干细胞影响的系统性研究较为鲜见。本文探讨不同浓度地塞米松对体外培养人骨髓间充质干细胞成骨分化、增殖能力及凋亡率等方面的作用，旨在更深入地了解地塞米松对hMSCs生物学特性的影响。     材料与方法    1  主要试剂    DMEM培养基（Hyclone公

10、司）、地塞米松（Sigma公司）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）定量检测试剂盒（Sigma公司）、Annexin V凋亡检测试剂盒（Bender公司）、TRIzol（Sigma公司）。    2  人hMSCs的体外培养与观察    骨髓标本均取自无血液疾病或骨病的成年人，事先征得所有献髓者的同意。将抽取的红骨髓以磷酸缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）稀释制成悬液，小心叠加至淋巴细胞分离液之上，离心，收集呈云雾状的有核细胞层，接种于10%胎牛血清的DMEM培养

11、液中，置于37，5%CO2及饱和湿度条件下孵育定期换液，待细胞生长至90%融合时，消化传代。随机抽取生长良好的细胞分5组：1×10-9 、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L地塞米松组和不含地塞米松的对照组，实验组分别称为1×10-9 、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L组。利用倒置相差显微镜逐日观察细胞形态和生长情况。    3  四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定hMSCs的增殖率    取hMSCs以2000/

12、孔接种于96孔板培养，随机分组后加入指定浓度的地塞米松，对照组则不加地塞米松。6天后加无血清DMEM培养液100l，MTT 10l，置37孵育4小时，加入十二烷基磺酸钠（SDS）100l，37放置2小时，经酶标仪测定吸光度OD。依次测定各实验组和对照组细胞的相对增殖率ODMTT，每组测定14孔。    4  ALP活性的测定    hMSCs以2000/孔接种于96孔板培养，实验组加入不同浓度的地塞米松。培养8天后加入100l二已胺醇，50l 3mmol/L PNPP，37孵育30分钟，加入50l 0.2 mmol/L Na

13、OH终止反应，经酶标仪405nm波长测ODALP值。每组样本量为14孔，分别除以对应的ODMTT均数，得出ALP相对活性比值。    5  hMSCs凋亡率的检测    将hMSCs以5×103/cm2的密度接种于培养皿，分组用地塞米松处理，每组6皿细胞。地塞米松干预8天后，采用Annexin V/PI双染色法对hMSCs进行凋亡率检测。取沉淀细胞490l，先后加入Annexin V和PI工作液，暗处冰浴10分钟上机检测。每组样本量为6个，每个样本至少检测10000个细胞。    6&

14、#160; 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法检测细胞骨桥蛋白(osteopontin，OPN)基因表达    6.1  逆转录（RT）反应  取hMSCs，分组用不同浓度的地塞米松干预12天，TRIzol法抽提细胞总RNA，反转录反应合成cDNA。将配制好的反应混合物加灭菌纯水至20l，37水浴60分钟，进行反转录反应；97水浴5分钟，然后迅速置于冰上。    6.2  聚合酶链反应（PCR）扩增  引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。OPN引物的上游序列为：5'CTAGGCA

15、TCACCTGTGCCATACC3'，下游序列：5'CTACTTAGACTACTTGACCAGTGAC3'，扩增片段长度为330bp。以actin作为内参照，上游序列为：5'TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA3'，下游序列：5'CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG3' ，扩增片段长度为660bp。PCR条件设置如下：94预变性5分钟，94变性45秒，57退火60秒，72延伸90秒，共循环28次，最后72延伸10分钟，终止反应。    6.3  RTPCR产物电泳  取PCR产物5l，置于1.5%琼脂糖上，80V电压下电泳1小时，观察并拍照。    7  统计学分析    采用完全随机方差分析，均数间比较采用LSD法。处理软件：SPSS v11.00。结  果    1  hMSCs的形态学观察    原代接种24小时后即可观察到部分细胞贴壁，大多