结缔组织生长因子单链抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化程度及羟脯氨酸含量的影响

1、结缔组织生长因子单链抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化程度及羟脯氨酸含量的影响         11-03-25 11:48:00     编辑：studa20                 作者：刘朝朝，王西华，吴国球，苟丽霞【摘要】  目的:研究结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(ScFv)对博莱霉素诱

2、导的肺纤维化小鼠的治疗作用。方法：昆明小鼠36只，随机分为对照组、模型组和治疗组，每组12只;对照组气管内滴入生理盐水，模型组和治疗组气管内滴入博莱霉素(5 mg·kg-1)制备肺纤维化模型。第2天开始治疗组尾静脉注射ScFv(4 mg·kg-1)，对照组和模型组给予等量的生理盐水(约100 l·次-1)，3次·周-1。第14、28天分两批处理动物，用HE染色行病理组织学检查并进行纤维化分级，用酸水解法测定肺组织羟脯氨酸的含量。结果：对照组小鼠肺组织无纤维化形成;模型组肺组织可见肺泡破坏，肺泡间隔大量纤维化，肺组织中羟脯氨酸含量及纤维化程度较对照组明显增

3、高(P<0.01)。治疗组肺组织纤维化程度较模型组明显减轻，且羟脯氨酸含量较模型组显著降低(P<0.01)。结论：ScFv作为CTGF单链抗体可明显减轻纤维化程度，有可能成为治疗肺纤维化一种新的药物。 【关键词】  结缔组织生长因子单链抗体; 羟脯氨酸; 肺纤维化; 小鼠Abstract Objective: To investigate therapeutic effect of singlechain variable fragment(ScFv) against connective tissue grouth factor(CTGF) on bleomycinin

4、duced pulmonary fibrosis of Kunming mice. Methods： 36 Kunming mice were randomly divided into three groups: the control group, the model group and the treatment group, 12 rats in each group. Mice in the control group were injected with normal saline via trachea, mice in the model and treatment group

5、 were injected with bleomycin(5 mg·kg-1) via trachea for preparing models. Then, mice the treatment group were injected with ScFv(4 mg·kg-1) via intravenous, and the mice in the other groups were injected with normal saline(about 100 l·time-1)via intravenous, 3 times·week-1. Afte

6、r be modeled 14 and 28 days, dealing with animals by hematoxylineosin staining for histopathological examination and fibrosis grade, by acid hydrolysis for assaying lung hydroxyproline content. Results： There was no pulmonary fibrosis in the control group; in the model group, a large number of alveo

7、lus damaged, alveolar septum fibrosis, hydroxyproline content and fibrosis were significantly higher than that in the control group(P<0.01); in the treatment group, lung fibrosis was significantly alleviated and the content of hydroxyproline was significantly lower than that in the model group(P&

8、lt;0.01). Conclusion： ScFv against CTGF can delay the fibrosis, which may become a new cure for pulmonary fibrosis.Key words singlechain variable fragment against connectwe tissue growth factor; hydroxyproline; pulmonary fibrosis; mice肺纤维化是严重威胁人类健康的致死性肺部疾病，病人平均生存时间为35年。目前特发性肺纤维化病人呈逐年增多的趋势1-3,其病变以肺间质

9、中间质细胞的异常增殖、弥漫性或局限性成纤维细胞灶(主要由成纤维细胞和肌成纤维细胞组成)的存在为主要病理特征。研究证实成纤维细胞灶的数量与肺功能的减退、病情的进展和预后密切相关4。目前尚无有效的内科治疗手段可以逆转或者缓解自然病程的进展。鉴于结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)在成纤维细胞活化过程中发挥重要作用，因此，本实验目的在于通过拮抗CTGF在肺纤维化中的作用寻找肺纤维化新的治疗方法。本实验利用博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，通过监测各组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量及肺纤维化程度评分，观察CTGF单链抗体(ScFv)对小鼠肺纤维化的作用

10、。1 材料和方法1.1 实验动物及试剂昆明小鼠36只，雌性，平均体质量(18±1) g，购于南通大学医学院实验动物中心;博莱霉素(15 mg·支-1)，为日本化药株式会社产品;ScFv由本实验室通过基因工程技术获得;羟脯氨酸试剂盒由南京建成生物技术研究所生产。1.2 肺纤维化模型制作及标本采集参照文献5报道制作小鼠肺纤维化模型。实验小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组12只。对照组小鼠予50 l生理盐水气管内滴入,模型组和治疗组小鼠予博莱霉素(5 mg·kg-1)缓慢气管内滴入。第2天开始，治疗组小鼠尾静脉注射ScFv(4 mg·kg-1)，模型组及

11、对照组小鼠尾静脉注射等量生理盐水(约100 l·次-1)，3次·周-1。3组小鼠分别于第14、28 天，通过腹主动脉放血各处死6只。开胸取肺，将右下肺以100 g·L-1中性福尔马林固定,包埋、切片;左肺和右中上肺分别置液氮中保存备用。1.3 肺组织形态学分析将小鼠右下肺固定于100 g·L-1中性福尔马林24 h，经脱水、浸蜡、包埋后制作成石蜡切片(厚度约4 m)，HE染色后观察肺组织病理学改变，了解肺组织纤维化程度。由病理科医生在显微镜下观察肺组织病理学变化(双盲法)，根据Szapiel等6方法，将肺纤维化程度分级如下：(1) 无纤维化(-);(2) 轻度肺纤维化(+),病变范围<20%,累及胸膜及胸膜下肺实质，肺泡结构发生改变;(3) 中度肺纤维化(+)，病变范围20%50%，肺纤维化从胸膜开始蔓延，但仍属局部;(4) 重度肺纤维化(+)，弥散性肺纤维化，病变范围>50%，融合损伤伴广泛肺实质结构紊乱。肺纤维化程度计分：(-)为0分，(+)为1分，(+)为2分，(+)为3分。1.4 羟脯氨酸含量测定每个肺组织样本均称取30 mg，严格按照试剂盒说明书进行操作，最终测得各个样本羟脯氨酸的吸光