谈RNA干扰在乳腺肿瘤治疗中的研究进展

1、谈RNA干扰在乳腺肿瘤治疗中的研究进展摘要：RNA干扰(RNAi)现象是指内源性或外源性双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)介导细胞内的同源mRNA发生特异性降解,导致靶基因表达沉默，产生相应功能表型缺失。这一现象属于转录后的基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)机制。RNAi是广泛存在于生物界的古老现象,是生物体抵御病毒或其他外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制,是包括人类在内的从低等真核生物到哺乳动物体内天然存在的基因沉默机制，其抑制靶基因表达的效率远比反义核酸高，持续时间也更长,具独特优势及广泛的应用前

2、景1。1998年Fire2和他的同伴在线虫中首次发现RNAi现象以来,陆续有报道在植物和果蝇等其他各种生物中也发现了RNAi现象。目前普遍认为RNAi是机体细胞一种强有力的基因调控机制。典型的RNAi技术基本上对任何mRNA系列都有非常高的成功率3。但是在哺乳细胞中导入外源大分子dsRNA (30个碱基) 常常导致非特异性的基因沉默效应,因为它激活了核糖核酸酶而导致非特异性的RNA降解,2001年Elbashir4等证实在哺乳动物细胞中存在RNAi现象,介导RNAi的中间物质是小干扰RNA(siRNA)，siRNA小于30个碱基，不激活核糖核酸酶,而是通过序列特异性的方式诱导基因沉默效应，揭开

3、了RNAi应用于哺乳动物和人类研究的新篇章。关键词： RNA干扰；基因治疗；乳腺肿瘤1 RNAi的机制 物种之间RNAi的作用机制虽然有差异,但都要经历起始阶段和效应阶段两步生物进化上保守的过程5。在起始阶段,与内源性mRNA互补的各种方式产生的dsRNA进入细胞后,与一种核酸内切酶Dicer结合并被Dicer切割成2123个碱基长的小片段。Dicer是核酸内切酶家族中特异识别dsRNA的酶,它以三磷酸腺苷(ATP)依赖的方式从dsRNA的钝头或3端有小悬突的dsRNA上开始切割,然后再形成5末端为磷酸基，3末端为羟基并含有2个突出的单核苷酸的2123个碱基长的片段,这些小片段就是siRNA。

4、在效应阶段，一部分siRNA与Dicer形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)，RISC再与目的基因转录出的mRNA结合并降解该mRNA。这也是一个需要能量的过程。RISC以内切的方式降解mRNA,并且只是降解与siRNA互补的那部分序列,因此RNAi有很高的序列特异性。另一部分siRNA则作为引物,帮助RNA依赖性RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymerase，RdRp)以mRNA为模板合成新的dsRNA,这些新合成的dsRNA又可以与Dicer结合并被切割成siRNA,从而产生级联放大效应，因此只要微量的ds

5、RNA就可以引起RNAi6。2 RNAi技术的应用2.1 RNAi技术在基因功能研究中的应用 RNAi作为一种新的方法,在基因功能的研究上呈现出巨大的应用前景,提供了一种高通量分析的途径。Fraser等7与Gonczy等8曾采用此方法证实了线虫染色体和中早期胚胎细胞分裂及细胞代谢等有关的所有基因功能，并在约19 000个基因的线虫蠕虫中,构建了12 000种不同dsRNA文库用于研究其与复杂生命现象相关的基因的功能,如肥胖、衰老等。运用化学合成的siRNA可帮助确定脊椎动物基因的功能,而且已扩展至人类细胞的体外研究。Semizarov等9运用RNAi技术沉寂Rb1基因,其编码产物是细胞周期调控

6、的关键因子,结果细胞周期中G1/S和G2/M期的转换、DNA的复制和修复、有丝分裂、凋亡均受到影响。通过构建短的RNA文库或编码siRNA的DNA载体,已经分析了8 000个人类基因的功能。其与基因芯片等技术结合,可高通量地分析各基因的功能，RNAi在细胞中具有抑制或灭活特异基因的功能,可以产生类似基因“敲除”的效应,是功能基因组研究的有效工具,这一技术比基因敲除技术具有明显投入少、周期短、操作简单等优势,它的应用将为基因功能的研究开辟新途径10。2.2 RNAi在基因治疗中的运用 由于RNAi是针对转录后阶段的基因沉默,相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除,整个流程设计更简便、迅速、有效,为

7、基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制,控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。2.2.1 RNAi在抗病毒感染疾病中的运用RNAi技术在丙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒11、呼吸道合胞病毒、人类乳头瘤病毒12、疱疹病毒13、Rous肉瘤病毒14、丁型肝炎病毒15、流感病毒、登革热病毒16、轮状病毒17中得到了运用。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染率的持续上升是世界各国面临的最严重的公共卫生问题之一,目前仍没有有效的疫苗和特效治疗药物,而RNAi技术的出现为HIV感染的预防和治疗提供了新的可能；乙型肝炎病毒(HBV)的感染率在我国达10%,是引起肝硬化

8、、肝癌的最重要的原因,RNAi技术的出现也为HBV感染的预防和治疗提供了新的可能。2.2.2 RNAi在抗肿瘤治疗中的应用 肿瘤一直是基因治疗研究的重点对象,应用于肿瘤基因治疗的靶点有以下几种：突变或转位的基因，如ras、bcrabl18；过表达的基因，如抑凋亡基因bcl2、bag1、erbB19等；多药耐药基因,如Pgp；肿瘤生长因子基因，如黑色素瘤中的IL6、乳腺癌中的Her2；病毒癌基因，如与子宫颈癌有关的乳头状瘤病毒基因E6与E712；肿瘤侵袭转移相关基因,如fos与cxcr4；肿瘤血管形成相关基因,如vegf20，其他还有端粒酶等。以上靶点同样适用于RNAi治疗肿瘤。体外实验结果表明

9、，RNAi在肿瘤治疗中具有潜在的应用价值。3 RNAi在乳腺肿瘤治疗中的研究进展 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，居女性恶性肿瘤的首位。近年来，乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，发病年龄也明显年轻化，严重威胁着妇女的健康。得益于肿瘤分子病因学的巨大成就及RNAi技术的逐渐成熟，使RNAi成为治疗乳腺癌的手段之一成为可能。cxcr4基因在器官形成,脉管的生成,自体免疫,肿瘤侵润和HIV1病毒的感染等方面起到了重要的作用。研究表明21在具有高度浸润性人乳腺癌MDAMB231细胞中，cxcr4基因的表达活性非常高。RNAi抑制cxcr4基因的表达后,这些有高度浸润性的人乳腺癌MDAMB231细胞的浸润

10、性明显地下降。Bergamaschi等22通过RNAi介导产生了p53依赖的细胞凋亡,从而为表达野生型p53的肿瘤如乳腺癌等的治疗提供了新的可能。转录因子E2F1在调控细胞周期进展和细胞增生中起关键性作用23。有研究表明24在多种肿瘤组织中,E2F1高表达促进肿瘤发展和转移。在乳腺癌中,E2F1表达升高与乳腺癌的浸润性有关25，E2F1是乳腺癌的预测标记26。Milner27和Xia等28采用RNAi技术构建重组的表达E2F1 siRNA的逆转录病毒载体，将重组载体和空载体转染入人乳腺癌MCF7细胞中，结果显示重组的逆转录病毒载体转染组与对照组相比，E2F1 mRNA表达显著降低，采用逆转录病

11、毒做载体介导的RNAi能特异、显著地抑制目的基因的表达。目前肿瘤化疗失败的原因之一是肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药(MDR)。MDR是指由一种药物诱发,导致细胞对该药耐药的同时,对其他结构和作用机制无关的化疗药物亦产生交叉耐药的一种现象。其中,肿瘤细胞mdr1基因编码的一种分子量为170 kD的细胞膜P糖蛋白(permeabilityglycoprotein，Pgp)过度表达是导致肿瘤细胞产生MDR的重要原因。随着人们对MDR形成机制研究的深入,逆转MDR的方法也逐渐从Pgp蛋白本身转向MDR产生的源头mdr1基因。从分子生物学理解,因mdr1过表达而形成MDR的过程是：mdr1基因转录mdr1

12、mRNA翻译Pgp泵出胞内抗癌药物MDR表型。显然,在这一过程的上游阻止其发展效果最好29。Wu30等针对mdr1基因设计出与之同源的siRNA,连接到Psilence3.1H1Hygro载体上,转染入人乳腺癌细胞系MCF7/ADR中,经检测MCF7/ADR细胞经特异性siRNA作用后，Pgp的表达率由99.8%下降到12.3%，细胞对阿霉素的IC50由17.88下降到0.51 mol/L,证明了由siRNA引发的RNAi可特异性的降低mRNA水平,引发mdr1基因沉默,从而逆转MDR表型,提高乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。乏氧诱导因子1（HIF）1在人乳腺癌细胞MCF7中起抗肿瘤细胞凋亡的作

13、用，Wang31等设计HIF1同源的短发夹RNA并用脂质体导入经乏氧培养的MCF7细胞，结果显示肿瘤细胞凋亡增加，血管内皮生长因子的表达受到抑制，细胞周期进程延缓。脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）是长链脂肪酸生物合成终末步骤的催化酶，它能调节乳腺癌细胞对于雌激素雌激素受体介导的转录活性和雌激素依赖的细胞增殖、存活的不同敏感性状态。药理学阻断FASN的活性可明显增强雌激素雌激素受体介导的基因转录，而在乳腺癌细胞中用RNAi技术沉默FASN基因的表达则明显降低雌激素受体介导的转录的雌激素需要量，在激素依赖的乳腺癌细胞中阻断FASN的表达可促进肿瘤细胞的凋亡，从而降低肿

14、瘤细胞的增殖和活力32。(中间丝)波形蛋白是型中间丝蛋白，在上皮癌中频繁表达，并与癌细胞的高侵袭性及预后不良相关。在体外试验中，波形蛋白阳性表达的人乳腺癌细胞MDAMB231的侵袭性很高，McInroy33等用RNAi下调MDAMB231中波形蛋白的表达，结果显示乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力均受到抑制。转移是乳腺癌病人死亡的主要原因,翻译抑制蛋白30/CC3(translationinhibiting protein30/CC3,TIP30/CC3)为一转移抑制基因，Zhao34等在87例经手术切除的乳腺癌标本中用免疫组化方法测得TIP30/CC3的表达与腋窝淋巴结转移(P=0.000 8)及脉

15、管侵犯(P=0.001 6)明显负相关，用RNAi技术沉默TIP30/CC3的表达后，癌细胞的侵袭性明显增强，为乳腺癌的治疗提供一个新的靶点。 RNAi作为一种基因治疗技术的研究才刚刚开始,与其他基因治疗一样，影响RNAi技术治疗疾病的问题依然很多，将其真正应用于临床造福人类尚待时日。而且，最近的研究表明，小于30个碱基的siRNA或其慢病毒表达载体在哺乳细胞内也会诱导非特异性基因沉默反应35，36。这种现象是否具有普遍性有待进一步证实，但在基因功能及基因治疗研究的实践中，RNAi的非特异性基因沉默现象不容忽视。【参考文献】 1 Nagy P，ArndtJovin DJ，Jovin TM.Sm

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