格列酮对内皮祖细胞增殖、黏附及迁移能力的影响

1、格列酮对内皮祖细胞增殖、黏附及迁移能力的影响         08-07-05 14:14:00     作者：林杰    编辑：studa0714【摘要】  目的:观察罗格列酮(rosiglitazone，Ros)对体外培养内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs) 增殖、黏附及迁移能力的影响。方法:以密度梯度离心法获取脐血单个核细胞，培养7 d后收集贴壁细胞并分为正常对照组、单独Ros

2、 (1mol/L、5mol/L及10mol/L)组、H2O2（500mol/L）氧化应激模型组、Ros(1mol/L、5mol/L及10mol/L)和H2O2共同干预组，培养24 h。用流式细胞仪检测细胞表达CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin并用荧光显微镜观察细胞吞噬DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1来鉴定EPCs。分别用CCK-8、普通光学倒置显微镜、改良的Boyden小室检测EPCs的增殖、黏附和迁移能力。结果:与正常对照组相比，单独Ros干预组呈浓度依赖性促进脐血来源的EPCs增殖、黏附及迁移能力（均P<0.05），但是Ros 5mol/L和10m

3、ol/L组间没有显著差异（P>0.05）；与H2O2氧化应激损伤组相比，Ros能呈浓度依赖性改善H2O2对EPCs增殖、黏附及迁移功能的抑制（均P<0.05），Ros 5mol/L和10mol/L干预保护组之间没有显著差异（均P>0.05）。结论:噻唑烷二酮（TZDs）类药物Ros除具有激动PPAR-受体降糖作用外，还具有抗氧化应激损伤作用。Ros能促进EPCs功能，改善H2O2致EPCs功能的氧化应激损伤。 【关键词】  罗格列酮 内皮祖细胞 过氧化氢 氧化应激    Abstract:  Objective: To stu

4、dy the effect of rosiglitazone on the ability of proliferation, conglutination and transfere of endothelial progenitor cell in vitro. Methods: Total mononuclear cells were isolated from the umbilical cord blood with ficoll density gradient centrifugation, after the red    内皮祖细胞（endoth

5、elial progenitor cells， EPCs）被认为是表达CD34/CD133/VEGFR-2的一群细胞，可以分化为内皮细胞，参与成体血管新生，同成熟内皮细胞相比具有迟发性的高增殖性。EPCs具有干/祖细胞增殖分化的特性，大量的动物实验和一些临床研究证明，EPCs是治疗缺血性疾病和修复血管内皮的良好种子细胞，具有巨大的临床应用潜能。越来越多的研究结果揭示，心血管危险因素如高血压、糖尿病、高血脂、年龄、吸烟都会抑制EPCs的功能，促进细胞衰老和凋亡1，2，EPCs的数量和功能可作为心血管疾病危险程度新的预测因子。近年来我国的糖尿病发病率明显上升，糖尿病被认为是冠心病的等危症，糖尿病患

6、者10年心脑血管疾病发病率大于20%。噻唑烷二酮(TZDs)Ros是选择性激活过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor-，PPAR-）激活剂,是治疗糖尿病的常用药。最近研究发现，TZDs类药物具有抗炎、抗免疫、保护血管内皮、抗动脉粥样硬化、降血压等胰岛素增敏效果的外作用3-5。本实验旨在观察Ros在体外正常培养和H2O2氧化应激损伤模型下对EPCs功能的影响，为明确Ros治疗糖尿病外的血管保护作用提供新的依据。    1  材料和方法    1.1

7、0; 材料  6%羟乙基淀粉（购自Sigma公司），纤维连接蛋白（购自Roche公司），VEGF（购自Peprotech EC公司），PE-CD34（购自Caltag laboratories），FITC-VE-cadherin（购自Bender system公司），PE-VEGF-2及FITC-AC133（购自RD System），胎牛血清、M199（购自GIBCO公司），Dil-ac-LDL（购自Molecular probe公司），FITC-UEA-1、rosiglitazone（购自Sigma公司），改良的Boyden小室(江苏海门麒麟医用仪器厂生产)，CCK-8细胞计数试剂

8、盒（购自日本株式会社同仁化学研究所），胃癌细胞株(SGC7901，中国科学院上海生科院细胞资源中心提供)。    1.2  EPCs培养及鉴定    1.2.1  人脐血培养EPCs：外周血采集于温州医学院第一附属医院分娩室（已获得知情同意）。参考文献6，取健康孕妇分娩后脐血50 ml，6%羟乙基淀粉沉淀红细胞，以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞，以5×106/cm2接种于包被有纤维连接蛋白的6孔培养板中，每孔加入2 ml包含有20%胎牛血清、VEGF(10 ng/ml)，青霉素(100 IU/ml)及链

9、霉素(100 IU/ml)的M199培养液，置37 、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。3 d后，洗去未贴壁细胞，添加培养液继续培养，以后每隔3 d换培养液。    1.2.2  EPCs鉴定：在培养的第7天，细胞以0.25%胰酶消化，制成1×106/ml的单细胞悬液，加入荧光标记的抗CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133单克隆抗体各10l(1mg/ml)，流式细胞仪分析内皮祖细胞CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133的表达情况。根据EPCs具有吞噬DiI-ac-LDL的特性，将DiI-ac-LDL

10、以2.4g/ml的终浓度加入培养液共孵育3 h，以2%的多聚甲醛固定10 min，再加入3l FITC-UEA-1(避光操作)，于37 孵育1 h。荧光显微镜下观察。以不加DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1的同批培养细胞为对照。阴性对照采用SGC7901。    1.3  实验分组  在培养第7天后，以0.25%胰酶将各孔细胞消化下来制成细胞悬液，以等数量细胞接种，随机分为正常对照组、Ros组(浓度分别为1、5、10mol/L)、H2O2（500mol/L）氧化应激损伤模型组、Ros+H2O2共同干预组，每组6孔培养24 h后，进行细胞

11、功能检测。    1.4  CCK-8增殖能力检测  单细胞悬液以1×104/孔的接种密度接种到96孔板，随机分组培养24 h后，更换新鲜培养液，每孔加入10l CCK-8细胞计数试剂，于37 孵育2.5 h，酶标仪450 nm下读取吸光度OD值。    1.5  黏附能力检测  单细胞悬液以5×104/孔的接种密度接种到24孔板，随机分组，培养24 h后，各组细胞以0.25%胰酶消化制成细胞悬液，以相同细胞数接种96孔板，置37 培养箱中培养30 min，洗去未贴壁细胞，倒

12、置显微镜下随机选取10个视野(×400)，计数黏附细胞数。            1.6  迁移能力检测  单细胞悬液以5×104/孔的接种密度接种到24孔板，随机分组，培养24 h后，各组细胞以0.25%胰酶消化制成细胞悬液，并计数。将培养液100l加入改良Boyden小室的下室，将2×104/ml EPCs悬浮在150l培养液，注入上室，培养24 h，刮去滤膜上未移动的细胞，用甲醛固定，苏木素染色，随机选择4个显微镜视野(×200)

13、，计数迁移的细胞。    1.7  统计学处理方法  用SPSS12.0统计软件进行统计分析，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者采用LSD检验，方差不齐者采用Dunnett's T3检验。    2  结果    2.1  EPCs鉴定培养3 d洗去不贴壁细胞及碎片后，可见典型细胞集落:中间为大量的圆形细胞， 层层叠叠，外周为纺锤形细胞，向外扩散(见图1A)。培养第7天荧光显微镜检显示:细胞吞噬DiI-ac-LDL，显微镜下激发红色荧光(见图1B)，细胞吞噬FITC-UEA-1，显微镜下激发绿色荧光（见图1C），空白对照及阴性对照均无荧光。用流式细胞仪分析表明，表达CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin的细胞分别为(51.21±3.53)%、(19.15±3.45)%、(39.24±3.61)%及(54.28±3.56)%。    2.2  Ros对EPCs增殖能力的影响  由表1可知，与对