生物工程导论

1、36第一章绪论生物工程是生命科学和工程科学的交叉科学。生物工程学科的任务是促进和实现生命科学的实验室研究成果向应用领域的转化。1。1生物工程的学科基础以生物科学和生物技术为基础，结合化学工程、机械工程、控制工程、环境工程等工程学科,研究和发展利用生物体系或其中的一部分生产有益于社会的产品或达到一定社会目标的过程工程科学.生物工程的研究对象包括活的生物体或它们的一部分。生物工程的任务就是为细胞的生长和目标产物积累创造最好的条件，研究开发最适合的工艺路线和设备,实现工业化生产以满足社会需要。1。2生物工程的研究领域生物工程的研究领域包括：基因工程、细胞工程、酶工程、微生物工程（发酵工程）及生物分离

2、工程。1.2.1基因工程DNA是遗传的物质基础，1967年第一个基因工程产品-人胰岛素通过定位突变的方法使所表达的蛋白质产物的结构和功能发生变化，根据需要设计新的蛋白质氨基酸序列，已经发展成为一门新的交叉学科蛋白质工程。1.2。2细胞工程细胞是构成包括人类、动物、植物和微生物在内的几乎所有生物的基本单元。哺乳动物的干细胞（即未分化的细胞）也具有全能性和无限繁殖的能力.发酵工程和生物分离技术的进步则是提高细胞培养工程和目标产物回收过程效率的可靠保障。1。2.3酶工程几乎所有的酶都是蛋白质，酶又具有催化剂的功能，即能够降低化学反应的活化能、加快反应速率,在反应中不消耗，反应结束时恢复到原来的状态。

3、酶工程是研究酶的分离、提纯及利用酶作为生物催化剂，实现化学转化，合成各种产物或达到人类所需社会目标的工程科学。 酶催化反应的特点是很高的效率和专一性1。2。4发酵工程发酵工程已经泛指所有细胞(动物、植物、微生物及基因工程细胞）的大规模培养并获得目标产物的过程。1。2。5生物分离工程与其他分离过程类似，生物技术产品的分离方法也是根据被分离对象及主要杂质的物理化学性质设计分离提纯流程，但是生物技术产品的分离也具有其特殊性,主要表现：（1）目标产物的浓度低（2）目标产物和杂质的物理和化学性质十分接近，而且成分非常复杂（3）目标产物往往具有生物活性（4）在许多应用领域，生物技术产品有很高的纯度和安全性

4、要求。第二章 基因工程2.1概述2。1。1基因工程的诞生基因工程的诞生于1973年2.1。1。1理论上的三大发现（1）20世纪40年代发现了生物的遗传物质是DNA 1934年Avery（2)20世纪50年代提出了DNA的双螺旋结构 1953年Watson和Crick提出了DNA的双螺旋结构（3)20世纪60年代确定了遗传信息的传递方式 1961年，Monod和Jacob提出 每三个核苷酸组成一个密码子，代表一种氨基酸,1966年全部破译了64个密码,叙述了中心法则，提出遗传信息流，即DNARNA蛋白质2.1.1。2技术上的三大发明（1）工具酶 限制性核酸内切酶称为“剪刀”，把DNA连接酶比喻成

5、“缝纫针线 ”（2)载体 (3)逆转录酶 1970年,Baltimore等人和Temin等人同时在各自的实验室发现了逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。在完成以上三大理论发现和三大技术发明后，基因工程诞生的条件已经成熟。1973年，斯坦福大学的Cohen等人进行了另一个体外重组DNA实验并成功地发现了细菌间性状的转移。这是人类历史上第一次有目的地进行基因重组实验，是第一个实现重组体转化的成功例子，1973年被许多科学家称为基因工程元年。 体外快速扩增技术即聚合酶链式反应(PCR）2.1。2基因工程的内容2.1.2。1基因工程的定义将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基

6、因能在受体内复制、转录、翻译表达的操作过程称为基因工程。基因工程的实施至少有四个必要条件：工具酶基因载体受体细胞基因工程也称为基因克隆或DNA分子克隆2.2基因工程的理论基础2.2.1DNA 的结构与功能基因工程的核心是重组DNA2。2.1。1DNA的组成核苷酸分子中有四种不同的碱基,即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C)2。2.1.2DNA结构1953年Watson和Crick提出了DNA的双螺旋结构，阐明了DNA分子的二级结构决定DNA的双螺旋结构的因素有:氢键的形成、碱基的堆积力、磷酸基之间的静电斥力、碱基分子内能的作用等DNA复制有如下特点:DNA的复制从特定的位点

7、开始，这个位点称为复制起始点,在复制起始点双链DNA解旋,形成复制叉半保留复制,每一双链体都是由一条亲链和一条新合成的子链组成DNA的复制具有高度的忠实性虽然DNA聚合酶是DNA复制的主酶。然而DNA复制是多种酶和蛋白因子协同有序工作的结果。DNA解旋酶的功能是在复制叉处使双螺旋DNA解旋2.2.2DNA的变性、复性与杂交在加热或某些试剂的作用下，DNA配对碱基之间的氢键结构受到破坏，双链DNA的多核苷酸链能完全分离，分离过程称为变性或熔解.当复性的DNA分子由不同的两条单链分子形成时,称为杂交。2。2.3遗传信息的传递方向中心法则DNA（基因）RNA蛋白质（性状）2。2。3.1RNA的转录转

8、录是基因表达的关键一步，DNA分子中所储存的遗传信息，必须转录成信使RNA才能通过蛋白质生物合成的过程转变成具有生物活性的蛋白质。2.2.3。2逆转录和逆转录酶以DNA为模板，在RNA聚合酶(依赖于DNA的RNA聚合酶）的催化下合成RNA的过程称为转录，而将以RNA为模板,在逆转录酶（依赖于DNA的RNA聚合酶）催化下合成DNA的过程称为逆转录。2.2。3.3翻译蛋白质的生物合成翻译就是将以核苷酸形式编码在mRNA中的信息转变成多肽链中特定的氨基酸顺序。翻译过程是非常复杂的生物反应过程，需要大约200多种以上的生物大分子参与，包括核糖体、mRNA、tRNA、氨酰tRNA合成酶、各种可溶性的蛋白

9、因子（起始因子、延伸因子、释放因子)等参加并协同作用，从而完成蛋白质的生物合成，体现了生物体的功能基因性状.2.2.4基因的表达与调控基因根据功能不同分为结构基因、调节基因和操纵基因。2.3基因工程工具酶基因工程的操作，是分子水平上的操纵，它依赖于一些重要的酶作为工具来对基因进行人工切割和拼接等操作.一般把这些切割DNA分子、进行DNA片段修饰和DNA片段连接等所需的酶称为工具酶。按用途分:限制性内切酶连接酶修饰酶识别和切割双链DNA分子内特殊核苷酸顺序的酶统称为限制性内切酶，简称限制酶。其他基因工程的工具酶：DNA聚合酶、逆转录酶、T4多核苷酸酶和碱性磷酸酶等。2。4基因工程载体2.4。1基

10、因工程载体的定义外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞，这种能承载外源DNA片段（基因）并带入受体细胞的传递者称为基因工程载体。2.4。2用于原核生物宿主的载体2.4。2。1质粒载体质粒是能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在.某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒.2.4。2。3柯斯质粒柯斯质粒是将噬菌体的粘性末端和大肠菌质粒的抗氨苄西林素基因相连而获得的人工载体，含一个复制起点，一个或多个限制酶切位点、一个cos片段和抗药基因，能加入40 50kb的外源DNA，常用于构建真核生物基因组文库。2.4.4。1Ti质粒2.4.5用于动物宿主

11、的载体2。4.5。1用于昆虫细胞的载体 杆状病毒2.4。5.2用于哺乳动物细胞的载体猿猴空泡病毒40(SV40)作为载体2。4.6基因工程载体的必备条件和简单分类必备条件 能够进入宿主细胞 载体可以在宿主细胞中独立复制 要有筛选标记 对多种限制酶有单一或较少的切点,最好是一个切点DNA重组使用的载体分类克隆载体穿梭载体表达载体2。5目的基因的获得基因是具有遗传功能的DNA分子上的片段，平均长度约1000bp。1975年Sanger等人发明了加减法，能够直接分析100 500个核苷酸的DNA片段，取得了DNA测序的重大突破。 基因库也叫基因组文库，是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组

12、体方式保持在适当的宿主中。 基因文库,也叫cDNA文库,经克隆后形成文库，cDNA文库和基因库的不同在于，cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分,便于DNA重组是直接使用。2.5.1.2基因组文库的筛选有三种通用的鉴定方法：一是用标记的DNA探针进行DNA杂交；二是用抗体对蛋白质进行免疫杂交：三是对蛋白质的活性进行鉴定.（1） DNA杂交法双链DNA分子可以分子可以通过热处理或碱变性的方法变性成单链DNA分子。退火后有的DNA的两条链分别来自不同的DNA分子,即形成了杂合DNA分子。（2） 免疫反应法若一个目的基因DNA序列可以转录和翻译成蛋白质，那么只要出现这种蛋白质，甚至只

13、需要该蛋白质的一部分，就可以用免疫的方法检测.（3） 酶活性法如果目的基因编码一种酶,而这种酶又是宿主细胞所不能编码的，那么就可以通过检查酶活性来筛选目的基因的重组子。2。5.2真核生物目的基因的获得（cDNA方法、DNA的化学合成法、PCR法)2.5。2。1cDNA方法cDNA文库的组建步骤：分离表达目的基因的组织或细胞从组织或细胞中制备总体RNA和mRNA合成第一条cDNA链,合成第一条cDNA链需要mRNA作为模板、预先设计的cDNA合成引物、逆转录酶及4种脱氧核苷三磷酸和相应的缓冲液等第二条cDNA链合成cDNA的甲基化和接头的加入双链cDNA与载体的连接2。7目的基因导入受体细胞目前

14、用做基因克隆受体的原核生物主要是大肠杆菌和枯草杆菌。最早应用于基因工程，至今仍最广泛使用的受体细胞是大肠杆菌.大肠杆菌表达产物常常在细胞内形成不溶性包涵体，以不正常的蛋白质折叠形式存在，产物无生物活性。 枯草杆菌主要用于分泌型表达,缺点是表达产物容易被枯草杆菌分泌的蛋白酶水解,而且重组质粒在枯草杆菌中的稳定性较差。将外源重组子分子导入受体细胞的方法很多，其中转化（转染)和转导主要适用于原核的细菌细胞和低等的真核细胞(酵母），而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。原核细胞的转化过程就是一个携带基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞、并在胞内复制和表达的过程。转化过程包括制备感

15、受态细胞和转化处理。感受态细胞是指处于摄取外界DNA分子的生理状态的细胞.转导是指通过噬菌体（病毒)颗粒感染宿主细胞的途径将外源DNA分子转移到受体细胞内的过程.聚乙二醇（PFG）和多聚赖氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物，可在原生质体表面形成颗粒沉淀，使DNA进入细胞内。哺乳动物细胞能捕获粘性附在细胞表面的DNA磷酸钙沉淀物，并能将DNA转入细胞中，从而实现外源基因的导入。脂质体是人工构建的由磷脂双分子层组成的膜状结构。 粒子轰击法普遍应用于转基因植物,无论植物器官或组织都能应用。2。8重组体的筛选重组体筛选的方法很多，归纳起来可分为两种：在核算水平或蛋白质水平上筛选。从核算水平筛选克隆子可

16、以通过核酸杂交的方法。这类方法根据DNADNA、DNARNA碱基配对的原理，以使用基因探针技术为核心.从蛋白质水平上筛选克隆子的方法主要有：检测抗生素抗性及营养缺陷型、观测噬菌斑的形成、检测目标酶的活性、目标蛋白的免疫特性和生物活性等。2。8.1利用抗生素抗性基因2.8.2营养缺陷互补法 若宿主细胞属于某一营养缺陷型，则在培养这种细胞时的培养基中必须加入该营养物质后,细胞才能生长；如果重组后进入这种细胞的外源DNA中除了含有目的基因外再插入一个能表达该营养物质的基因，就实现了营养缺陷互补，使得重组细胞具有完整的系列代谢能力，培养基中即使不加营养物质也能生长2。8.3核酸杂交法2。8。4通过免疫

17、反应筛选2。8.5通过酶活性筛选2.9目的基因的高效表达大肠杆菌的许多优点确保了它在基因工程中的地位,是一个最常用的基因高效表达系统。枯草杆菌是另一种常用的原核表达系统。酵母菌是常用的真核生物表达系统2.9。2影响目的基因表达的基本因素影响外源DNA转录的主要因素是启动子的强弱。启动子时宿主细胞的RNA聚合酶专一结合并其实转录合成mRNA聚合酶识别，因此必须将外源基因置于大肠杆菌启动子控制下.Lac、lacUV5、tac等都是常用的强启动子.转录终止信号也会影响转录,人工合成的基因后面一定要装配合适的终止子，以减少能来那个消耗及保持转录的准确性.强启动子往往需要强终止子予以匹配。翻译水平影响外

18、源基因表达的重要因素是翻译起始区。翻译是在核糖体上进行的，因此mRNA上必须有核核糖体的结合部位（称SD序列）.对于人工合成的基因来说，密码子的优化亦很重要，应该采用宿主菌的偏爱密码子、保持嘌呤和嘧啶碱基配对反应的能量平衡。翻译后的加工修饰也将影响表达水平。包括切除新生肽键N端甲酰蛋氨酸、形成二硫键、糖基化和肽键本身的后加工等。2.9.3目的基因的不溶性高效表达采用高密度培养及工程菌生长和诱导表达相分离的两段培养技术，包涵体的产量可以达到很高的水平,对于不需要翻译后修饰的蛋白质产物，利用生长速度快、培养基简单的大肠杆菌为宿主细胞，采用不溶性融合蛋白表达策略仍是一种提高目的基因表达效率的很好选择

19、。2.9。4目的基因的高效可溶性表达对于不少目的蛋白,可通过降低启动子强度和减少培养温度的手段成功地实现高水平的可溶性表达。2。9.5 目的建议你的高效分泌型表达目的基因的分泌型表达有两种情形：目的蛋白分泌到细胞周质中和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外.2.9.6基因工程宿主菌的改造目前基因工程常用宿主是大肠杆菌K12系列和B系列已经发现在一种细菌(透明菌）内含有起输送氧作用的血红蛋白基因,通过将血红蛋白基因整合到大肠杆菌宿主中后,大肠杆菌就能在贫氧条件下培养生长，从而提高了菌体生长密度和外源蛋白的表达产率。2。9.7利用细胞培养工程手段提高基因表达水平2。9.7。1提高工程菌的质粒稳定

20、性提高工程菌的质粒稳定性需要从质粒构建和培养方法改进两条途径进行研究。在质粒构建时，一般都插入抗生素抗性基因，另外，在质粒构建时应该加入称为par和cer的位点，par位点能够在细胞分裂工程中使质粒分布更均匀，cer位点则能够防止多聚体质粒的形成,从而能从源头上提高质粒稳定性. 采用细胞生长期和诱导表达时期分开的分段培养策略。 采用固定化细胞培养也有利于提高质粒的稳定性2.9.7.2 大肠杆菌的培养可分为合成培养基、半合成培养基和复合培养基.高密度培养采用半合成培养基2.9.7.3 减少乙酸等抑制性副产物的形成（1)降低比生长速率（2)降低培养温度(3）限制性流加葡萄糖（4）基因工程菌培养和乙

21、酸分离耦合过程 2。10。1基因工程制药1982年第一个基因工程药物人胰岛素就在美国的Eli Lilly公司研究成功并投放市场。基因工程药物常分为四类：激素和多肽类、酶、重组疫苗及单克隆抗体.第一类基因工程药物主要针对因缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病，这类蛋白质主要以激素类为代表，如人胰岛素、人生长激素、降钙素等。第二类基因工程药物属于酶类,如tPA、尿激酶及链激酶等.第三类属于疫苗，分为基因工程亚单位疫苗、载体疫苗、核酸疫苗、基因缺少疫苗及蛋白质工程疫苗等。第四类产物单克隆抗体2。10。1。2 1989年我国第一个基因工程药物干扰素-lb上市，标志着我国基因工程制药实现了零的突破。第三章细胞

22、是构成生物体的基本单元，细胞工程就是通过大规模的细胞或组织培养,获得所需要的产品。细胞可以分为动物细胞，植物细胞和微生物细胞三大类。1999年12月，美国科学杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，肝细胞的研究陈果排名在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前,名列十大科学进展的首位，那是因为肝细胞的发现否定了动物细胞不具有全能型的传统观念，为人类健康提供了新希望，干细胞是一类极特殊的来自胚胎或成体的未分化细胞，同时具有不断增长繁殖的功能以及想多种功能细胞分化的潜能.由于具备不断增值与定向分化的双重功能，肝细胞具有可用于组织器官生产或新药删选的巨大潜力。离体培养环境可分为铁臂和复生长两种方式.动物细

23、胞的培养主要有间接培养，流加培养和关注培养。非致死和致死两大类。少数属于非致死的细胞，如癌细胞，表皮细胞及成纤维细胞等。一般，将从特定功能组织器官中分离后无法增值或处于未稳定传代培养前的动物细胞称为原代或初代细胞，而将能温度稳定传代培养并能连续生长繁殖的细胞称为连续化细胞.原代细胞是直接从组织器官中分离得到的，原代细胞培养一般由组织器官解剖分离,解聚和离体细胞培养三个步骤组成，解聚分机械分离和酶解两种方法。酶法分离是目前应用最广的动物细胞分离法，最常使用的酶有胰蛋白酶，胶原酶，弹性蛋白酶等。它们可以单独或混合使用。原代培养为一系列细胞培养的第一步，原代细胞的生理就带些特性差异非常大，属于不稳定

24、细胞系。一旦原代细胞进行了传代培养（亦称转种），便称为细胞系.细胞系中往往存在有若干表型，相似或相异的细胞世界系，若其中一世系,经过选殖克隆、物理性细胞分离,或其他选择技术，而在培养的细胞群体中辨识出其特殊表型性质,该细胞便称为细胞株.动物细胞呈圆形，如线粒体是进行呼吸的地方,高尔基体是进行蛋白质糖基化和折叠等后加工的场所，粗内质网膜则是合成蛋白质的场所等.动物细胞的离体培养最初采用天然体液培养基,如小鸡胚胎萃取液、血清、淋巴液等。化学成为明确的培养基配方.旋转瓶和中空纤维反应器是比较常见的动物细胞大规模贴壁培养的反应器。微载体是一种能悬浮于溶液中，直径为100200um的球状颗粒。聚苯乙烯、

25、葡聚糖和胶原等都是通用的为载体材料，通过加工而成为球状颗粒。悬浮培养反应器大多在微生物反应器基础上发展形成,以通气搅拌罐最常见细胞悬浮培养操作方式有间歇培养，补料分批培养和灌流培养等。植物细胞培养具有全能型即单一的离体细胞在一定环境下分化成不同的细胞组织乃至整个植株。植物体受到切割等伤害后会产生愈伤组织，愈伤组织的形成实际上是一种创伤反应,是植物脱分化的结果,产生愈伤组织的植物器官可以是种子，根、茎、叶等。进行植物细胞大估摸培养的基本步骤是，1建立细胞株,2，将愈伤组织转移到液体培养集中，3。扩大培养，现已建立了针对植物细胞的而不培养法, 及使用生长培养及使细胞大量增殖,达到一定的细胞密度，然

26、后再改用适合细胞产物积累得到培养基，促进细胞启动次级代谢途径并提高产物的产量。 培养条件的优化 物理因素，1光对光的需要与否,2温度25。左右3PH值，5-6之间。 化学因素1溶氧，2植物细胞悬浮培养的培养基。植物细胞培养的细胞生理特性1植物细胞尺寸较大,2植物细胞对剪切力非常敏感，3易沉降。4植物细胞生长缓慢，5植物细胞生长与次级代谢产物的合成无显著关联,6易染菌。从鞘蕊花属细胞培养得到的迷迭香酸,以细胞干重计含量高达27%。自1996年美国大面积推广种植转基因作物以后，转基因食品以惊人的速度向全球扩散。常见的建立转基因动物方法有显微注射法，逆转录病毒法与干细胞法等方法，1显微注射法2逆转录

27、病毒感染法3胚胎干细胞4精子载体法5体细胞核移植法从转基因动物的乳汁中获取对人类有益的基因工程产物,不但具有产量高，容易提纯的优点，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性.因此被称为动物乳腺生物反应器。干细胞即未分化的细胞，是一类具有自我更新和分化发育潜能的原始细胞。干细胞分胚胎干细胞和组织肝细胞两类，肝细胞研究最早是从胚胎干细胞开始的，经过6个月的增殖，这些胚胎干细胞，胚胎肝细胞具有形成所有组织和器官的能力，具有全能型，只能发育分化成一个系统中的几种细胞，但不能生成其他系统的细胞，因此这些干细胞称为“多能”干细胞，“多能”干细胞继续分化发育，将生成更加专门化的细胞,即“专能”

28、干细胞。它们只能再增殖分化为一种类型的“终端”细胞。多能及专能干细胞统称为组织干细胞。由于干细胞的数目很少，因此需要在体外对干细胞进行非分化性增殖，这需要许多生长因子和间质细胞的共培养，纤维细胞生长因子得到培养集中培养，上皮生长因子，胚胎干细胞人体发育起始于卵子的受精,产生一个能发育为完整有机体潜能的单细胞，及全能型的受精卵造血干细胞造血干细胞分布于骨髓，外周血和脐血中,尤其脐血含有丰富的造血干细胞。造血干细胞是造血细胞的种子，体内所有血细胞，包括红细胞、白细胞、血小板等，都是由它分化发育而来，也是人们认识最早的干细胞之一。间充质干细胞是分化发展为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌肉细胞和骨

29、髓基质细胞的干细胞,在成年后主要存在于骨膜下和骨髓腔中，也分布于肌肉，胸腺和皮肤中神经及其他干细胞存在于成体神经组织中，具有再生神经元，星形胶质细胞和少突状细胞的潜在能力，组织工程的研究几乎遍及人体所有的器官或组织,20世纪90年代,美国FDA已批准组织皮肤工程及自体软骨细胞移植修复关键软骨部分缺损益用于临床,并开始产业化进程组织工程按组织器官的构筑方式可分为两个部分:组织再生工程和组织替代工程组织工程的三种基本要素是细胞、支架材料与调节因子人工支架的作用包括人工细胞外基质、空间确保膜、生长因子控制释放、组织生长的支撑体、免疫隔离膜和生物反应器等。酶是一类生物催化剂，其化学本质为蛋白质，同时又

30、具有催化剂的功能。第四章酶工程 酶是一类生物催化剂,其化学本质是蛋白质，同时又具有催化剂的功能.酶工程是蛋白质化学与工程学相互交叉渗透、相互结合并发展而形成的一门新的技术科学。酶工程是研究和开发酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化、酶及固定化酶的反应器、酶与固定化酶的应用等的工程科学酶的命名 1酶是依据酶作用的反应物2酶所催化的反应性质来命名3酶的来源或酶的其他特点来取名酶分为6类，1氧化还原酶类,2,转移酶类3，水解酶类4.裂合酶类5异构酶类，6，合成酶或链接酶类。酶的活力是指酶催化特定底物转化成产物的速率。酶的活力还常常是制定酶制剂价格的最重要的参考指标。酶活力的单位是:单位时间、单位质量酶

31、蛋白所催化的底物反应或产物生成的物质的量酶的三级结构是在二级结构的基础上,借助于各种次级键盘绕城具有特定肽链走向的紧密球状构象，寡聚酶是有2个或2个以上亚基组成的酶，分子质量一般高于30KD，具有四级结构酶催化的特点，1，反应条件温和，2，极高的催化效率，3，高度专一性，（底物专一性、反应专一性、立体化专一性）4，辅酶和辅因子，许多酶只有在某些非蛋白质成分存在时才表现出催化作用，人们将这些非蛋白质成分称为辅助因子，其中能通过透析出去的称为辅酶,不能通过透析除去的就叫做辅基因子，5.酶催化活性的调控机制酶反应速率与底物浓度的关系P103 E代表游离酶，ES为酶与底物的复合物，S为底物，P为产物，

32、k+1、k1、k+2为相应各步反应速率常数。固定酶具有的优点：可以重复多次使用，而且在大多数情况下，酶的稳定性也有明显改善催化反应后,酶与底物以及产物容易分开,产物中没有残留酶，易于分离纯化，使产品的质量有大的提高反应条件易于控制，可实现生物催化反应的连续化和自动控制酶的利用效率高，单位酶量催化的底物量增加，而用酶量则大为减少比水溶性酶更合适于多酶催化反应。固定化方法按所用载体和操作方法的差异分为:载体结合法、包埋法和交联法等三类，载体结合法包括物理吸附法、离子结合法、螯合法和共价结合法等，包埋法包括聚合物包埋法、疏水相互作用法、微胶囊包埋法、脂质体包埋法等 只有L型氨基酸才具有生理活性，外消

33、旋氨基酸必须转化为L型氨基酸，主要的拆分方法有物理化学法、化学法和酶法等三种，其中以酶法最为有效,能够生产纯度较高的L氨基酸.生物传感器的发展非常迅速，生物传感器是用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具，大致可以分为酶传感器、微生物敏感器、免疫传感器和场效应晶体传感器等四大类。其中利用酶的催化作用制成的酶传感器是问世最早、成熟度最高的一类生物传感器。P116 蛋白质侧链基团修饰可以改变蛋白质表面电荷和疏水性，从而影响其催化活性和稳定性。酶蛋白中个别氨基酸的置换可以采用点突变的方法很容易就可以完成，点突变是研究蛋白质结构与功能关系的重要工具。一般地说,经过修饰的酶可显著提高酶

34、活力、增加稳定性或降低抗原性、显著提高酶的使用范围和应用价值。酶的新用途-靶酶及酶标药物 每一种酶都有一些特定的抑制剂，通常将这种酶称为该抑制剂的靶酶。靶酶的意义 传统上，人们只有根据某些化合物对特定疾病有一定治疗作用作为设计药物的线索,大量合成出其类似物，从中进行筛选，并获得某种疗效最好的药物。根据统计，每种统计,每种新药的上市需要从大约10万种化合物中筛选得到，可以想象新药研究和开发所需的巨大人力、物力和资金投入!随着人类基因组计划完成对疾病引发机理的深入研究,人们发现许多疾病的发生都是由于基因突变引起的酶蛋白表达水平的变化引起的。这样一来，只要对这些酶蛋白的活性水平进行调节，就可能治愈疾

35、病。这种对疾病具有关键作用的酶就是靶酶,筛选得到的能影响和调节靶酶活性并能治疗疾病的药物就成为酶标药物。非水系统中的酶催化的特点绝大多数有机化合物在非水系统中的溶解度高于水溶液根据热力学原理,一些在水中不可能进行的反应，有可能在非水系统中进行与水相比,酶在非水系统中的稳定性比较高从非水系统中回收反应产物比从水相中容易在非水系统中酶很容易回收和反复使用。根据酶的作用原理,用人工方法合成的具有活性和催化作用的非蛋白质结构的化合物称为人工合成酶或人工模拟酶。P120分子印记技术自20世纪80年代初Cech和Altman各自独立地发现了RNA具有生物催化功能后，人们发现除蛋白质才能有酶的催化功能以外,

36、某些RNA和DNA分子也具有催化功能.目前已知的核酸酶大致上可以分为剪切型核酸酶和剪接型核酸酶。抗体酶是指通过一系列化学与生物方法制备的具有催化活性的抗体.第五章微生物工程按细胞生长是否需要氧气，发酵过程可以分为两类：好氧和厌氧发酵。好氧发酵过程以氧作为电子受体。典型的如动植物细胞培养，利用微生物发酵生产抗生素、有机酸、氨基酸、酶制剂、单细胞蛋白等需要向反应器中通入无菌空气，有时甚至纯氧以满足微生物生长和代谢对氧的需求。由于氧在水中的溶解度很低。微生物工程的发展史 大约在9000年前就已经开始了原始的啤酒生产。公元前6000年左右，在黑海与里海的外高加索地区，就已经开始种植葡萄和酿制葡萄酒。在公元前2400年左右，在埃及第五王朝的墓葬壁画上，就有