MTT试验方法步骤

1、一.悬浮细胞 MTT实验时，由于离心弃上清会造成一定程度的细胞丢失，而且操作又麻烦.请 教各位老师，不用弃上清的 SDS-DMF,酸化异丙醇的方法的具体步骤和参考文献.谢谢！ 1 .介绍一种巨噬细胞杀伤活性的 MTT检测：于 24 孔培养板中加入 1M09/L腹腔巨噬细胞 （1ml/孔），培养 2h 后洗去未贴壁细胞，加入不同浓度的 MDP。收集对数生长期的 UMR106 细胞，调整细胞浓度至 1X108/L,加入各孔，效靶比（E/T）为 10:1,再培养 24h,充分振荡。每孔取 100dl的 UMR106 细胞移入 96 孔培养板，各孔加入 5g/LMTT20dl,培养 4h,再加入 10

2、%SDS100 屋测定 570nm处的 A 值。计算公式如下：杀伤活性（）=（1实验组 UMR106 细胞的 A 值/对照组 UMR106 细胞的 A 值）X00% 本方法参考文献，JiaoH,ShanWM,OheY,etal.AnewMTTassayfortestingmacrophagecytotoxicitytoL1210anditsdrugresistantcelllinesinvitro.CancerImmunolImmunother,1992;35:412416 2 .SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在 490nm520nm 波长处其 OD 值与活细胞

3、数成良女?的直线关系。SRB法已被 NCI选定作为筛选抗癌药物的 新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的 MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于 MTT法。除此之外 SRB法还有以下优点：（1）操作时间短，细胞固定和染色仅需 90 分钟 左右，而 MTT加样后还需培养 4 小时。（2）没有严格时间限制，在 TCA 固定后或 SRB结合后的细胞均可存放，Monks 指出样品保存 7 天，测定的 OD 值下降不超过 2%8。（3）可以测定悬浮细胞，采用16%的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之 MTT 法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。 要用 MT

4、T法，可以选用无酚红的无色培养基，离心吸取部分上清，不要吸走底部细胞和 formazan,乘 ij下部分放烤箱烘干。就不会影响你的测定了。 二.悬浮肿瘤细胞 MTT法检测细胞生长抑制率时采用的细胞裂解液配方及如何配制 1 .细胞种于 96 孔板中，6 小时左右后，加入受试药物，继续培养 72 小时后加入 20ul5mg/ml 的 MTT,37c温育 4 小时，加入 100ul三联液（10%SDS5%异丙醇一 12mMHCl）,温育 1220 小时，用平板读数计在 570nm处测定每孔的光密度值（OD 值）.细胞增殖生长抑制率和增效率分别按公式计算 2 .检测悬浮细胞生长抑制率用 CCK-8 试

5、剂比较好，操作比较简单，误差比较小。 三.悬浮细胞 mtt,何时加药物？细胞接种 96 孔板时？ 1 .一般文献报道的方法，是贴壁细胞在细胞贴壁后加药物（一般为上板后 24h）,而悬浮细 胞是上板同时加。 但是，我个人的经验，药物加的时机并不是固定的，具体要根据你实验本身的要检测的指标。如果你要做有关细胞增殖的药物，加药的时机影响不大，主要是药物的作用时间起决定性因素。但是，如果你要检测的是其他一些指标，比如，如果你想做药物对细胞黏附功能的影响，可能就要在细胞贴壁以前就要加药了。 2 .贴壁细胞一般在试验前 1-2 日接入 96 孔板， 太晚，细胞在传代后有一个 16 小时左右的停滞期，此时代

6、谢变慢，增殖缓慢，及对数曲线的底部，此时的 MTT数值太低了， 太早了，实验时候，细胞生长过头，此时有死亡和凋亡的细胞，实验时本底又过高，让试验时落在对数早中期最好 四.悬浮细胞如何做 mtt? 1 .一种方法加 MTT,孵育，离心，去上清，每孔加入 DMSO。振荡 10 分钟后选择波长，测 OD 值；这种方法较麻烦，尤其是没有平板离心机的情况下。 另一种方法是酸化异丙醇法：细胞悬液离心，弃上清，加 MTT,孵育，加入酸化异丙醇，离心，取上清测 OD 值。后者推荐使用。 2 .悬浮细胞可以用 EP管离心，但是，一般悬浮细胞是养在培养板里的，如果你再把悬浮细胞转到 EP管里，再离心，会很累的。最

7、好用平板离心机离心，如果没有，只能转到 EP 管里再离了。但是，转来转去的，会丢失细胞不说，还有可能影响到细胞的活力。 DMSO 和酸化异丙醇原理应当差不多，活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮座化物（MTT）由黄色还原为兰色的甲赞，后者溶于有机溶剂（二甲基亚枫、酸化异丙醇），甲赞产量与细胞活 性成正比。可用酶标仪测定其 OD 值。 3 .异丙醇中加入 HCl配成 0.04mol/L。 不同的时间加入不同的药物，你可以使用可拆式细胞培养板呀。 一般实验你要做几个复孔的，所以，一个板子，有的时候显得还不够用呢。 你还可以用二十四孔板，六孔板呀。多买几个板子，同时培养，但是在不同的时间处理。 比如二十四小

8、时的时候拿出一个来做 MTT。再过二十四小时，第二个板子就已经培养了四 十八小时，你再拿出来做 MTT。 五 .SDS方法： 用 0.01NHCL溶解 SDS（要求纯度要高，sigma 的最好），10%;加入 MTT继续培养 4 小 时，96 孔培养板不用离心，直接加入孔（培养量为 100ul孔），置 CO2 培养箱过夜， 直接测定。溶液颜色很稳定，72 小时内变化不大。 六 .S180 细胞是悬浮的，能否用 MTT测定 OD 值？ 1 .可以用 MTT测定 OD 值的。具体方法如下：细胞种于 96 孔板中，6 小时左右后，加入 受试药物， 继续培养 72小时后加入 20ul5mg/ml的 M

9、TT,37c温育 4小时， 加入 100ul三联液 （10%SDS5%异丙醇12mMHCl）,温育 1220 小时，用平板读数计在 570nm 处测定每孔的光密度值（OD 值）.细胞增殖生长抑制率和增效率分别按公式计算。（吸取上清后， 我用 DMSO 与细胞混匀后作用 5-10 分钟。570nm的波长。一般不用三联液的。） 2 .tedzhwrote:可以。具体方法如下： 1 .细胞种于 96 孔板中，加入受试药物。 2 .继续培养至所需要的时间。 3 .10ul10mg/ml 的 MTT,1200rpm,5min. 4 .37C、5%CO2、饱和湿度温育 4 小时。 5.4000rpm,10

10、min 6 .倒板去上清。 7 .加入 DMSO 振荡反应 10MIN 8 .测 A570 七.我在做药物对细胞的影响， 细胞是 K562,现在要做 MTT,在加 MTT之前， 是不是一定要把药物洗掉？因为是悬浮细胞，怎么洗？洗会不会对细胞数有影响？ 1 .贴壁细胞也没有说还要洗掉药物的，但是在加入 DMSO之前，实际上还是把培养液给吸 掉了，而药物就溶解在培养液里头。 如果你的悬浮细胞 MTT法最后是通过离心后去上清，加 DMSO 溶解结晶的方法来检测的话，实际上你还是洗掉了药物的干扰了。 如果刻意地离心弃上清液加 MTT,或者离心弃上清液一一培养液重悬一一离 心一一弃上清液一一加 MTT,

11、往往得不偿失，会在瓶壁上/或者操作过程中损失掉一些细 胞的，影响实验结果。 2 .也有人说当体积小于一百微升时可以直接加 MTT,如果不影响结果的话。还要看你的药物 和 MTT有没有反应。 八.mtt原理和方法： 1 .MTT法的原理是：包括肿瘤细胞在内的有核细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶能把 3-(4,5)-2-曝咏-(2,5)-二苯基澳化四氮唾蓝(MTT)还原成蓝色的甲 2 .MTT法测细胞相对数和相对活力 活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使 MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。 其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。 11:接种细胞：用含 10%胎小牛血清得培养液配成单个细

12、胞悬液，以每孔 100010000 个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 100 或 200U1. 2:培养细胞：同一般培养条件，培养 24-48 小时 3:加入受试药物，一般 5-7 个浓度，每个浓度 3 个复孔，同时设空白对照，不加药物的阴性对照和阳性对照。. 4:呈色：培养 24-48小时后，每孔加 MTT溶液(5mg/ml用 PBS配)20ul.继续孵育 4 小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上 清液。每孔加 100ulDMSO,振荡 10 分钟，使结晶物充分融解。 5:比色：选择 490nm 或 570nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值注意事

13、项： (1)选择适当得细胞接种浓度。 (2)注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 (3)若药物与 MTT能够反应，第四步时可以先离心后弃去培养液，小心用 PBS冲 2-3 遍 后，再加入含 MTT的培养液。 九.上面的回复都是从书上抄的，我第一次做时，就按书上的做，就见不到 formasan 形成， 第二次我把细胞加大到 200000/ml,MTT反应时间加至 5 小时才出结果， 所以要看自己的细胞决定具体试验条件。另外关于选择 490nm或 570nm 波长，如果用二甲亚碉中止反应，用 492nm；如用酸化异丙醇，用 570nm。附上我做 MTT是查的资料，希望有

14、用 用 MTT比色法测定细胞增殖活性，取对数生长期细胞，以不同浓度加入 96 孔板，细胞浓度从 高到低每孔依次为 28X104,14X104,7X104,3.5104,1.7504,0.82504,0.41204,0.206X104,0.103104，每孔100 臼置于 37C,5%CO2、饱和湿度条件下孵育一定时间(分别做出培养 1,2,3,4 天的板子)，然后在反应板中加入 MTT(5mg/ml),每孔 10 科或 20 膜同上条件继续培养 4h,离心去上清。各孔加入二甲基亚碉(DMSO)或 10%SDS1001,溶解 MTT还原产 物,微型震荡器震荡 5min 后，室温放置 0.5h 分

15、别用全自动酶标仪测定 492nm波长吸光度(A) 值。结果如下图：(摘自MTT比色法的条件探讨方蓉，李芳秋等临床检验杂志 2003 年第 21 卷第 1期 ChineseJournalofClinicalLaboratoryScience,2003,Vol121,No11)。 MTT体外药敏实验： 细胞：取指数生长期细胞进行实验，细胞接种密度可查阅相关文献 试剂：药物工作液(终浓度)： 连续 10 倍稀释的 5 个浓度，如 30,3,0.3,0.03,0.003 MTT溶液： 临用前用生理盐水溶解，60C 水浴助溶， 浓度为 5mg/ml。 三联溶解液：SDS10g 异丁醇 5ml 10MHC

16、l0.1ml 用双蒸水溶解配成 100ml溶液 细胞接种与加药： 将一定密度的肿瘤细胞 90 小孔接种于 96 孔微量培养板内，然后加入药液 10 膜孔,每种药 5 个浓度（每个浓度相差 10 倍），一个浓度设 4 个复孔。每块板设一个空白调零孔，内加细胞培养液 100 闵不含细胞与药物。每种细胞设 6 个正常对照孔，加样 100 科吼（即有肿瘤细胞的培养液）,不含药物。接种完毕后在 37C,5%CO2 条件下孵育培养 48 小时。 1 .力口 MTT: 加 MTT溶液（5mg/ml）20 小孔,混匀后 37C,5%CO2 条件下孵育 4 小时。 2 .加三联液： 加溶解三联液 100 小孔，

17、混匀后 37c放置过夜以溶解甲膻。 3 .吸光度（A）测定： 测定波长为 570nm,校正波长为 630nm。 96 孔板附图于附件 ppt文件. D药物，Gc为正常对照，Cb 为空白调零孔. 以下的 protocol 供参考： 1.Makeasolutionof5mg/mLMTT1dissolvedinPBSandfiltersterilized. 2.5hoursbeforetheendoftheincubationadd20uLofMTTsolutionfromsteponetoeachwellcontainingcells. 3.IncubatetheplateinaCO2incuba

18、torat37oCfor5hours. 4.Removemediawithneedleandsyringe. 5.Add200uLofDMSOtoeachwellandpipetteupanddowntodissolvecrystals. 6.Putplateintothe37oCincubatorfor5minutes. 7.Transfertoplatereaderandmeasureabsorbanceat550nm 司徒先生授课： 1、制备单细胞悬液：0.25%胰蛋白酶消化，用培养液配成细胞悬液 接种细胞：每孔 103-104 细胞（100200ul）接种于 96 孔板中 2、预培养：

19、37C,5%CO2 及饱和湿度下培养 24h 施加影响因素：如药物，培养 3-5 天 3、力口 MTT（0.5%）:每孔 1020ul,培养 424h 4、溶解结晶物：吸弃孔内培养液，勿破坏孔内结晶物，每孔加入 150ulDMSO,震荡 5-10 分钟 5、比色：选择 490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，先调零（按调零键），再按统计键，然后各孔分别按测量键，最后按统计键，自动打印比色结果 6、绘制曲线：以细胞数或作用因素（如药物浓度）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制曲线。 十.我在 MTT中遇到几个问题，百思不得其解，问了不少老师，也是不得要领，盼望各位行家能够指导一二。 (1

20、) .关于测量波长的问题，我在文献上见有用 490nm,还有用 570nm,甚至还有选用其他 波长的，不知波长的选择是根据什么做出来的？ (2) .我在文献(FreshneyRI.Cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique.ThirdEdition.AJohnWiley&Sons,Inc,Publication.NewYork.1994.)中见到， 在用DMSO溶解结晶紫以后， 再加入Sorense缓冲?夜(0.1M氨基乙酸， 0.1MNaCl,用 1MNaOH调节 pH至 10.5),不知 Sorense缓冲液在此处是什么作用？ (3)

21、.我是用 DMSO 溶解结晶紫的，我遇到一个老师，他说我这是一个老土的办法，建议我改用 SDS,不知 DMSO 与 SDS的区别在什么地方？有什么优缺点？ 请各位行家多加指导。我在这里先谢过了。 你好， 关于波长的选择， 我在实验前也查了不少资料， 测定波长(measureabsorbance)范围在 550600nm,校正波长(measureabsorbance大于 650nm,根据你处仪器情况，具体选择。(我查到多数外文文献中提到的测定波长为 570nm,校正波长为 630nm。) 这样选择的原因见附图，图中虚线部分为 MTT紫外吸收光谱，实线为甲膻(formazan)吸 收光谱，可见 5

22、50600nm 为甲膻的吸收高峰，在该范围内测定可提高检测的敏感性，且避 免 MTT干扰。而选择校正波长是为了去除细胞碎片，指纹(？)或其他非特异因素造成的 干扰(reducebackgroundcontributedbyexcesscelldebris,fingerprintsandothernonspecificabsorbance.),当然你可以不选择校正波长，在国内的不少文章中，并没有选择校正波长， 但国外文章一般都选择。 再上传有关文章，见附件，正所谓言之有据。 另外，我建议 zhjrun 兄有空再到 pubmed 等数据库中搜索有关文章，会有一个全面了解，不能只听一面之辞，我想作为一个研究人员应该这样。 关于选择 490nm 为测定波长，我看到文献中 MTS作用产物最佳测定波长为 490nm,若需要 了解具体情况，也