细菌的生理生化反应

1、实验十 细菌的生理生化反应一、目的1.11.1了解细菌鉴定中常用的生理生化试了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理验反应原理1.21.2掌握测定细菌生理生化反应的技术掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法和方法 二、原理各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。不同微生物因具有不同的酶系统，分解利用不同微生物因具有不同的酶系统，分解利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，其糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，其发酵的类型和产物也不相同。细菌的生理生发酵的类型和产物也不相同。细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中有很大作用。化反应在菌株的分类鉴定中有很大作用。

2、 三、材料3.1 菌种菌种大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichiacoli）产气肠杆菌（产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）普通变形杆菌（普通变形杆菌（Proteusvulgaris）枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的斜面菌种）的斜面菌种 3.2培养基培养基糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基、H2S试验培养基、柠檬酸盐培养试验培养基、柠檬酸盐培养基基3.3试剂试剂V.P试剂、试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、甲基红试剂、

3、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、溴甲酚紫指示剂、碘液。碘液。3.4器具器具恒温培养箱、试管、移液管、杜氏小管。恒温培养箱、试管、移液管、杜氏小管。四、步骤 ( (一一) )糖类发酵试验糖类发酵试验（二）（二）乙酰甲基甲醇试验乙酰甲基甲醇试验(V(VP P试验试验) )（三）（三）甲基红试验（甲基红试验（M.R.M.R.试验）试验）（四）（四） 吲哚试验吲哚试验（五）（五） 柠檬酸盐试验柠檬酸盐试验 （六）（六） 硫化氢试验硫化氢试验（七）（七） 淀粉水解试验淀粉水解试验(一) 糖类发酵试验原理原理 可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是

4、否产酸产气作为鉴定菌种的依据。为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂，经培养后根据指示剂的颜色变化来判断剂，经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。 材料材料菌种：大肠杆菌、变形杆菌菌种：大肠杆菌、变形杆菌 培养基：葡萄糖发酵培养液、乳糖发酵培养液试管培养基：葡萄糖发酵培养液、乳糖发酵培养液试管 步骤步骤 1试管标记试管标记 取分别装有葡萄糖和乳糖发酵培养液试管各取分别装有葡萄糖和乳糖发酵培养液试管各2支，每种糖发支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌

5、、普通变形菌。酵试管中均分别标记大肠杆菌、普通变形菌。2接种培养接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中。置以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中。置37恒温箱中培养，培养恒温箱中培养，培养24h-48h，观察结果。，观察结果。与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“”表示；如培养液表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用用“”表示。表示。培养液中的杜氏小

6、管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用产酸并产气，记录用“”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用性反应，记录用“”表示。表示。结果观察结果观察（二） 乙酰甲基甲醇试验(VP试验) 原理原理 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称（为二乙酰

7、，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称（+）反应。）反应。 材料材料 菌菌 种种 :大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichiacoli）、）、 产气肠杆菌（产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes） 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养液培养基：葡萄糖蛋白胨水培养液步骤步骤 1标记试管标记试管 :取取2支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。菌、产气肠杆菌。 2接种培养接种培养 :以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中。置以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中。置37恒温箱中，培养恒温箱中，培养2448h。取出

8、以上试管，振荡取出以上试管，振荡2min。加入等量试剂；振荡试管，以使空。加入等量试剂；振荡试管，以使空气中的氧溶入，置气中的氧溶入，置37恒温箱中保温恒温箱中保温1530min。若培养液呈红色，记录为若培养液呈红色，记录为V.P.试验试验阳性反应（用阳性反应（用“”表示）；表示）；若不呈红色，记录为若不呈红色，记录为V.P.试验阴性试验阴性反应（用反应（用“”表示）。表示）。 结果观察结果观察（三）（三） 甲基红试验（甲基红试验（M.R.试验）试验）原理原理 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于

9、糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH值下降至以下，值下降至以下，使甲基红指示剂变红。使甲基红指示剂变红。 材料材料 菌种菌种 同试验同试验 培养基培养基 同试验同试验步骤步骤 同试验同试验1标记试管标记试管:取取2支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。肠杆菌、产气肠杆菌。 2接种培养接种培养 :以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中。以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中。置置37恒温

10、箱中，培养恒温箱中，培养2448h。取出以上试管，各加入取出以上试管，各加入23滴甲基红指滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层。液上层。n若培养液上层变成红色，即为阳性反应，若培养液上层变成红色，即为阳性反应，用用“”表示；表示；n若仍呈黄色，则为阴性反应，用若仍呈黄色，则为阴性反应，用“”表示。表示。 结果观察结果观察（四）吲哚试验原理原理 :有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入吲哚试吲哚。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入吲哚试剂（

11、对二甲基氨基苯甲醛试剂）时，该试剂与吲哚作用，形剂（对二甲基氨基苯甲醛试剂）时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。成红色的玫瑰吲哚。 材料材料菌种：同菌种：同VP试验试验 培养基：蛋白胨水培养基培养基：蛋白胨水培养基 试剂：二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。试剂：二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。 步骤步骤 1试管标记试管标记 :取装有蛋白胨水培养液的试管取装有蛋白胨水培养液的试管2支，分别标记大支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。肠杆菌、产气肠杆菌。 2接种培养接种培养 :以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，置置37恒温箱中培养恒温箱中培养2448h

12、。取出以上试管，在培养液中加入乙醚取出以上试管，在培养液中加入乙醚12ml，经充分振荡使吲哚萃取，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入入510滴吲哚试剂滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察）影响结果观察）。如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用为阴性反应，阳性用“”、阴性用、阴性用“”表示。表示。 结果观察结果观察（五

13、）柠檬酸盐试验原理原理有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；而另一些细菌则不能有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐后，产生碱性化合物，利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐后，产生碱性化合物，使培养基的使培养基的pH升高，当培养基中加入升高，当培养基中加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时，就会由溴麝香草酚蓝指示剂时，就会由绿色变为深蓝色。（溴麝香草酚蓝的指示范围为：绿色变为深蓝色。（溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于时呈黄色，小于时呈黄色，pH在在时为绿色，时为绿色，pH大于时呈蓝色。）大于时呈蓝色。）材料材料菌

14、种：同菌种：同VP试验试验 培养基：柠檬酸盐培养基（固体斜面）培养基：柠檬酸盐培养基（固体斜面）步骤步骤 1试管标记试管标记 取装有柠檬酸盐培养基固体斜面的试管取装有柠檬酸盐培养基固体斜面的试管2支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌。菌。 2接种培养接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管，置置37恒温箱中培养恒温箱中培养2448h。结果观察结果观察（六）硫化氢试验原理原理有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的

15、铅盐或铁盐等，就形成黑色产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。的硫化铅或硫化铁沉淀物。材料材料菌种：大肠杆菌、变形杆菌菌种：大肠杆菌、变形杆菌 培养基：培养基： H2S试验培养基（固体）试验培养基（固体）步骤步骤 1试管标记试管标记:取装有取装有H2S试验试验固体培养基的试管固体培养基的试管2支，分别标记大肠支，分别标记大肠杆菌、变形杆菌杆菌、变形杆菌 。 2接种培养接种培养:以无菌操作分别用以无菌操作分别用挑取少量菌苔到以上相应试挑取少量菌苔到以上相应试管做管做，置，置37恒温箱中培养恒温箱中培养2448h。结果观察结果观察（七）淀粉水解试验原理原理

16、有些细菌可产生淀粉酶水解培养中的淀粉为糊精，或进一有些细菌可产生淀粉酶水解培养中的淀粉为糊精，或进一步水解为麦芽糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝。步水解为麦芽糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝。材料材料菌种：大肠杆菌、枯草杆菌菌种：大肠杆菌、枯草杆菌 培养基：淀粉培养基（固体）培养基：淀粉培养基（固体）步骤步骤 1培养皿标记培养皿标记 取装有淀粉培养基（固体）的培养皿一只，在培养皿两侧取装有淀粉培养基（固体）的培养皿一只，在培养皿两侧分别标记大肠杆菌、枯草杆菌。分别标记大肠杆菌、枯草杆菌。 2接种培养接种培养 以无菌操作分别用接种环挑取少量菌苔到培养皿相应部位以无菌操作分别用接种环挑取少量菌苔到培养皿相应部

17、位做做，置，置37恒温箱中培养恒温箱中培养2448h。结果观察结果观察取出平板，加上少量碘液，轻轻摇动，使碘液铺满平板表面，观察菌落周围是否出现透明圈及圈的大小。六六实验结果与分析实验结果与分析1 配制培养基配制培养基糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基淀粉培养基淀粉培养基色色H2S试验培养基试验培养基柠檬酸盐培养柠檬酸盐培养 每组配制一种培养基每组配制一种培养基,300mL.,300mL.实验内容及分工实验内容及分工,时间安排时间安排2 灌装试管灌装试管糖发酵培养基（葡萄糖）糖发酵培养基（葡萄糖）-水培养液水培养液糖发酵培养基（乳糖）糖发酵培养基（乳糖）-水培养液水培养液葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基-水培养液水培