金黄地鼠舌癌血管生成的组织学定量研究

1、    金黄地鼠舌癌血管生成的组织学定量研究        摘要目的：动态研究金黄地鼠舌癌发生、发展过程中血管生成的变化规律。方法：采用组织学定量方法，结果：舌部癌前阶段即有血管生成现象，从癌前病变、原位癌、浸润癌发展的不同时期，血管生成现象持续存在，并随着癌细胞的增殖、浸润更为明显，血管增生主要由周边向中心呈向心性增生，肿瘤发展至一定阶段肿瘤中心出现血管生长的停滞。结论：血管生成是舌癌生长、发展的重要先决条件。关键词仓鼠；舌肿瘤；新血管生成；定量分析Histological

2、 quantitative study on theangiogenesis in lingual carcinoma in hamsterZheng Genjian, Wen Yuming, Li Longjiang,et al.Department of stomatology,473rd Hospital of PLA,Lanzhou 730070AbstractObjective:To study the angiogenesis dynamically during the development in lingual carcinoma in hamster.Method:Tong

3、ues of hamsters were treated with DMBA by conventional procedure,the carcinogenesis and angiogenesis were observed with pathological quantitative analysis.Results:The number density and area density of blood vessels increased with the development of DMBA-induced tongue lesion (P<0.05),the most bl

4、ood vessels were observed in the invasive carcinoma and more in peripheral part than in central (P<0.05).Conclusion:Angiogenesis plays an important role in the development of tongue carcinoma.Key wordsHamsters;Tongue neoplasms； Neovascalariyation;Quantitative analysis早在1971年，Folkman就提出了肿瘤生长具有血管生成

5、依赖性这一概念。以后陆续有实验研究表明，肿瘤连续性生长必需有血管形成，当实体瘤生长到直径为2 mm时，如继续生长，就需要血管供应的保障。瘤细胞可能产生一种肿瘤血管生长因子(TAF)，促进血管内皮细胞的分裂出现新生毛细血管，进而沟通血流，进入肿瘤组织内，保证瘤组织的氧和营养，同时，新生血管为肿瘤代谢产物的排除提供了途径。因而，血管生成是肿瘤局部生物学行为的基础。然而，关于血管形成是否为肿瘤侵袭的主要先决条件尚有争议。正常舌组织发生癌变转化期间以及癌变后肿瘤生长的不同时期的血管增生情况和定量研究方面尚缺乏资料。本实验通过化学诱癌剂诱发金黄地鼠舌癌动物模型，采用组织学定量方法，动态研究肿瘤发生、发展

6、过程中血管生成的变化规律，为舌癌血管生成和局部生物学行为之间的关系及舌癌的治疗提供基础实验依据。1材料与方法1.1实验动物与分组68周龄叙利亚金黄地鼠48只，随机分为6组，每组8只。1组，空白对照组，第21周末处死。2组用5 g/LDMBA丙酮溶液涂布右舌侧缘中后1/3交界处+局部拔髓针刺激，于第9周末处死。3组、4组、5组、6组处理因素同2组， 分别于第12周末、15周末、18周末、21周末处死。1.2实验方法1.2.1墨汁血管灌注组织切片用10 g/L戊巴比妥钠按50 mg/kg体重腹腔注射将动物麻醉后，仰卧固定于手术板上，打开胸腔，显露心脏，经左心室插入导管至升主动脉，丝线结扎固定，再结

7、扎降主动脉，切开右心房，用3537生理盐水自左心室导管灌注冲洗头颈部血管，待右心房流出液清亮为止，然后用冲洗液冲洗。冲洗液中含罂粟碱0.12 g/L(用于松驰血管平滑肌)，肝素25 000 IU/L(用于抗凝血)，低分子右旋糖苷15 mg/L(维持血管内胶体渗透压以免组织水肿)。灌注30 g/L明胶墨汁溶液(将明胶按上述比加入中华墨汁中，加温至3637，搅拌混匀备用)，灌注压控制在1215 kPa，至舌体、口腔粘膜、牙龈及头颈部皮肤呈黑色，不致引起毛细血管破裂为度。取肿瘤及周围组织块，体积分数为10%甲醛固定，石蜡包埋，作与粘膜表面垂直切片，厚5 m，HE染色，光学显微镜下观察。1.2.2血管

8、生成的组织学定量研究将HE染色切片，置于四川联合大学形象分析研究所研制的MIAS-2000显微象分析仪下进行测量。高倍镜下(10×40)面积为0.502 4 mm2，分别计数肿瘤中心区和边缘区每个视野内的血管密度(血管数目/mm2)及血管面积密度(血管内腔面积/肿瘤组织面积)。每个标本肿瘤中心区和周边区依顺序分别测量10个视野，取平均数，得出各自的血管密度值和血管面积密度值。正常空白对照组及自身对照舌粘膜标本不分区域进行测量，方法相同，得出正常参考值。2结果显微象分析仪血管密度(条/mm2)、血管面积密度(%)计量结果如表1所示。13显示了墨汁微血管灌注情况。1正常舌粘膜墨汁灌注，粘

9、膜下层结缔组织中有散在血管分布，血管形态较正常。HE×20215周组，增生的基底细胞周围粘膜下结缔组织中血管增生明显，密度增大。HE×20321周组，癌巢周围血管增生更加强烈，血管密度更大，血管分布混乱，囊腔血管多见。表1各组动物粘膜下(或肿瘤内)血管密度及血管面积密度值(±s)1组2组3组4组5组6组周边区中心区周边区中心区血管密度(条/mm2)14.78±2.0716.32±1.6519.83±1.5825.48±1.5342.60±0.7041.58±0.7253.10±2.1542.47

10、±0.80血管面积密度(%)10.80±0.1412.50±0.4113.69±0.9514.03±0.4325.06±0.4723.69±0.4733.08±0.6224.33±0.47以上方差齐性检验经变量代换后为齐性。实验结果显示，各处理除2组外，血管密度明显大于对照组(P<0.05)。12周组血管密度较正常组增加约34.17%(P<0.05)；15周组增加约72.40%(P<0.01)；18周组增加约184.78%(P<0.01)；21周组增加约223.28%(P<0

11、.01)。而面积密度较对照组明显增加(P<0.05)，9周组血管面积密度较正常组增加约15.74%(P<0.05)；12周组约增加26.76%(P<0.05)；15周组增加约29.91%(P<0.05)；18周组增加约125.74%(P<0.01)；21周组增加约165.83%(P<0.01)。统计结果显示，各实验组间血管密度及面积密度均存在显著性差异，具有统计学意义(P<0.05)。5、6两组肿瘤中心区与周边区血管密度和面积密度均存在显著差异，具有统计学意义。二组间血管密度及血管面积密度中心区无显著差异(P>0.05)，而周边区存在显著差异(P

12、<0.05)。 3讨论Folkman1认为，实体肿瘤的繁殖至直径几个毫米以后，肿瘤细胞数量的每一增加，必须伴随有肿瘤中新生毛细血管网的诱发。虽然新生血管生成的确切机理尚不完全清楚，但大量研究提示，新生血管是由肿瘤细胞、肿瘤相关的炎症细胞、细胞外基质所释放的特别分子所诱发的，这种特别分子即肿瘤血管生成因子(TAF)。它分为二大类：一类直接作用于血管内皮细胞，刺激其分裂、增殖和游走2，另一类是通过激活宿主的某些炎症细胞(如巨噬细胞)，使之释放内皮细胞生长因子3，间接影响血管生成。新生成的血管通过对肿瘤组织提供氧份，营养物质以及通过消除肿瘤组织中的酸及毒性代谢产物而促进肿瘤生长。本实验结果表明

13、，在正常粘膜发生癌前病变前，血管增生不明显，与正常组织一致，进入癌前病变期，出现血管密度及血管面积密度的增加，进入成癌期，血管密度和面积密度增加更为明显。这说明了实体肿瘤的发展分为二个阶段：血管期和血管前期4。在血管前期，肿瘤组织几乎无血管生成，肿瘤大小常小于1 mm3；而在血管期，血管数目及肿瘤组织均明显增加，说明了肿瘤细胞数目的增加，必须依赖营养肿瘤的毛细血管的提前增加才能达到。血管生成可能是从癌前病变状态，转化至成癌期的开关。这和Sillman5，Chodak6，Jensen7等分别对宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌的研究结果一致。证实了生成血管的诱导和随之发生的新血管形成均先于肿瘤形成之前，血管

14、形成是肿瘤侵袭的重要先决条件。实验结果表明，从上皮异常增殖期向浸润癌发展过程中，随着癌细胞的增殖和浸润，发生了较为明显的血管增生现象，且肿瘤浸润生长明显侧的血管密度和血管面积密度增加更为显著。这可能与癌细胞增殖活跃区TAF的释放有关，而新血管形成又为癌细胞的迅速增殖提供了输送营养、氧分及排除代谢产物的条件。从本实验结果可知，18周组肿瘤的血管密度和血管面积密度已大大高出正常组、癌前病变期及重度上皮异常增殖期。且18周、21周组肿瘤周边区血管密度和血管面积密度均大于中心区，这表明肿瘤浸润期周边区血管新生更为活跃。肿瘤血管生成主要集中在细胞增殖活跃的周围，随着肿瘤的发展，中心区已开始出现血管增长停

15、滞的趋势，引起相对的血容量不足。这解释了肿瘤中心易坏死的现象。这种结果可能是由于肿瘤周边细胞活性更高，更有利于诱导TAF的产生。这和李龙江8对金黄地鼠颊囊癌的研究相似，但每一阶段血管生成的实际数量比颊囊癌大，增长幅度反而比颊囊癌小，这可能和舌部本身具有比颊囊更丰富的血供有关。本实验结果和Justin10、Shweiki11等的研究结果不同。他们发现最高血管密度位于肿瘤内，血管内皮生长因子mRNA在肿瘤坏死中心的周边特别密集，认为局部缺氧是血管内皮细胞生长因子表达的一个强诱发因素。这种结果不同可能和舌部血管丰富，至浸润癌形成时，肿瘤侵及肌层，该部分对TAF的反应更强烈，更容易诱发血管生成有关。肿

16、瘤血管的定量研究，已有许多报道，但尚无成熟的方法，结果也有许多争论。同是鳞癌，有研究认为周边区血管生长活跃，有的研究则认为是中心区生长活跃。这可能和研究的肿瘤原发器官的血管和解剖条件有关。但有一点可以肯定，即随着肿瘤的发展，血管密度和血管面积密度这两个涉及肿瘤中氧弥散及营养成分输送的重要指标均有明显增加。本实验采用同时检测血管密度与血管面积密度两个指标，动态研究了舌部肿瘤发生、发展各时期内血管生成强度肿瘤细胞和血管间的距离(血管密度)及肿瘤内循环血液与组织细胞的交换面积(血管面积密度)，证明血管生成确是肿瘤生长、发展的重要先决条件。作者单位：郑根建兰州解放军473医院口腔科730070温玉明李

17、龙江王昌美华西医科大学口腔医学院颌面外科参考文献1Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst,1990,82:42 Folkman J,Klagsbrun M.Angiogenic factors.Science,1987,235:4423 Polverini PJ,Leibovich SJ.Induction of neovascularization in vivo and endothelial proliferation in vitro by tum

18、or-associated marcophages.Lab Invest,1984,51:6354 Folkman J,Watson K,Ingber D,et al.Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia.Nature,1989,339:585 Sillman F,Boyce J,Fruchter R.The significance of atypical vessels and neovascularization in cervical neoplasia.Am J Obstet Gynecol,1981,139:1546 Chodak GW,Haudenschild C,Gitt